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流式细胞术原理

流式原理

BD LSRFortessa → 流式结果图

模型

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流式细胞仪的结构与抗原量化过程

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鞘液和样本在flow cell室中形成层流，使得sample处于轴心

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荧光信号显示原理

流式图的显示一般横坐标为荧光信号强度，纵坐标为细胞数，对应的一个点为一个细胞。

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流式分选原理

目的是将阳性细胞群单独分选出来

液滴形成：在流动室下面加一个喷嘴，并使其一定频率的震动，使液流形成液滴，理想状态下每四个液体包含一个细胞

如果通过的细胞为阳性表达的细胞，在通过喷嘴后，在一定延迟后（液滴延迟）给与该液滴一个电刺激，使其带正电荷，在下落的下方电场中偏向一侧，最后落到回收管中。

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喷嘴和上样速度选择

喷嘴

常见口径为70，85，100，130um

喷嘴一般大于5倍的细胞大小

tumor：15um

上样速度：

每Hz的频率等于每秒通过液滴数

目的是使4个液滴中一个细胞

分选参数

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panel设计

实操

样本制备

染色流程

1. 检测细胞膜表面蛋白表达水平

2. 流式检测胞内IFN-r的操作流程（胞内细胞因子）

3. 流式检测Treg细胞的操作流程（核内转录因子）

note：胞内、核内使用的固定破膜试剂不同

SOP

检测细胞膜表main蛋白表达水平

1. 取样：细胞计数，每个Sample去2-5×10^5（根据实验摸索）个细胞；

2. 染色：细胞离心（300g，5min），弃上清，加入30ul抗体染液重悬细胞；

   Note：常规染色体系30ul即可；细胞离心等待时间可以配置抗体染液；染液配制及细胞清洗均用流式Buffer，即PBS-F（adding 2% FBS）——加FBS目的是减少抗体的非特异性结合，以及增加细胞的存活

染色条件：

	条件1	条件2（Note-01）
温度	25℃	4℃
时间	30min	30-60min
适用性	常规染色	需要尽量降低背景的染色
案例	常规膜maker	IFN-r膜捕获实验；抗原特异性记忆B细胞染色；参见文献Methods

Note-01：染色、离心、Buffer均应预冷。

1. 抗体孵育：室温20℃左右、避光、30min

2. 染死活（可选）：离心后，死活染料重悬细胞；室温，避光，30min；

   常规实验，阳性占比比较高&细胞活性不错，为了减少时间，不加死活；活性不好）肿瘤单悬液，染稀有细胞一定要加死活

3. 清洗两遍：

   补加入1mlPBS-F，细胞离心；

   弃去上清（不用太干净，减少细胞损失），用1mlPBS-F重悬细胞，细胞离心；

   弃去上清（不用太干净，减少细胞损失），用0.5mlPBS-F重悬细胞；

4. 过滤后上机：

   Note:上机前一定要过滤，防止上样针的堵塞；

   一般用300目的滤网处理（300目=48um，指网孔直径）

5. 对照

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上机收样（调电压）

目的：样本、单阳管在检测范围内且信号和分辨率好

• 未染组-通道在10^2左右（有些调不到，因为自发荧光少，不强求）

• 全染组（阳性对照 OR 全阳可能性最大的组）-小于10^5

• 单阳管-小于10^5 可以调节FSC/SSC，不调荧光电压即可

使用FlowJo软件进行数据分析及常见问题

待学习

常用细胞周期流式检测方法 Cell Cycle Analysis by Flow Cytometry

DOI:10.21769/BioProtoc.1010328

摘要：细胞周期 (cell cycle) 是指细胞从上一次分裂完成到下一次分裂结束所经历的全部过程，包括分裂间期和分裂期 (M期)，其中分裂间期又可分为DNA合成前期 (G1期)、DNA合成期 (S期)、DNA合成后期 (G2期)。G0期是静止期细胞，它们暂时脱离细胞周期，停止细胞分裂，但在一定条件的刺激下，又可重新进入细胞周期进行分裂 (Cooper, 2000)。细胞是生命活动的基本单位，而细胞周期又与细胞的增殖和分化密切相关。因此，对于细胞周期的检测至关重要。细胞内的DNA含量会随细胞周期进程而发生周期性变化，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各阶段的百分比。常用于测定DNA含量的染料有碘化丙啶 (PI)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)、7-氨基放线菌素 (7-AAD)、Hoechst 33342、Hoechst 33258等。本文主要就其中两种常用染料PI (固定细胞染色) 和Hoechst 33342 (活细胞染色) 的实验方法、注意事项和结果分析展开介绍。

材料与试剂

1. 15 ml离心管 (Falcon, catalog number: 352097)

2. 5 ml流式管 (Falcon, catalog number: 352008)

3. 200目细胞过滤膜

4. Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, catalog number: B2261)

5. NaCl

6. Na2HPO4

7. KCl

8. KH2PO4

9. 70%乙醇

10. 碘化丙啶 (PI) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4170)

11. 核糖核酸酶 (Roche, catalog number: 11119915001)

12. 磷酸缓冲液 (1× PBS) (见溶液配方)

13. 碘化丙啶 (PI) 溶液 (见溶液配方)

14. 核糖核酸酶 (RNase) 溶液 (见溶液配方)

15. Hoechst 33342溶液 (见溶液配方)

仪器设备

1. 涡旋混合器 (其林贝尔, model: VORTEX-6)

2. 水平离心机 (Beckman Coulter, model: Allegra X-12R)

3. 光学显微镜 (Olympus, model: IX73)

4. 流式细胞仪 (BD FACSFortessa)

实验步骤

1. 固定细胞PI染色法 (Davies和Allen, 2007)

   1.1

   收集2 × 105细胞，200 × g离心2分钟，去除上清，并用1 ml 1× PBS (不含Ca2+、Mg2+) 清洗一次。

   1.2

   用0.5 ml预冷的70%乙醇重悬固定细胞，在涡旋器上一滴一滴地加入乙醇，4 °C固定30分钟以上。在醇类固定剂中-20 °C下可以存放几个星期。

   1.3

   200 × g离心2分钟，去除乙醇，并用1 ml 1× PBS清洗三次。

   1.4

   用含50 μg/ml PI和200 μg/ml RNase的0.5 ml 1× PBS重悬细胞，37 °C孵育30分钟。

   1.5

   无需洗涤，样品过200目细胞过滤膜后转移至流式管。

   1.6

   上机检测，用561 nm的激光激发PI，收集610/20 nm波段的发射光，低速上样，总共记录20,000个目的细胞。

2. 活细胞Hoechst 33342染色法

   2.1

   收集2 × 105细胞，200 × g离心2分钟，去除上清，用1 ml 1× PBS (不含Ca2+、Mg2+) 清洗一次。

   2.2

   用含10 μg/ml Hoechst 33342的PBS重悬细胞，37 °C孵育30分钟。 注：Hoechst 最佳浓度和染色时间需要根据具体的每种细胞来确定，一般浓度在5~20 μg/ml，孵育时间为30~120分钟。

   2.3

   无需洗涤，样品过200目细胞过滤膜后转移至流式管，放置冰上。

   2.4

   上机检测，用355 nm的激光激发Hoechst 33342，收集450/50 nm波段的发射光，低速上样，总共记录20,000个目的细胞。

注意事项

1. 一定要做细胞计数，确保细胞数与固定剂量和染料的浓度相匹配。一般来说细胞浓度控制在2 × 105~2 × 106细胞/毫升。

2. 贴壁细胞的消化时间要控制好，消化时间过长，细胞易成团。可边消化边观察。

3. 如果细胞标记荧光蛋白或需要做表面标记，不能使用醇类固定剂，可以使用醛类固定剂。使用醛类固定剂时可以加0.1% Triton X-100。

4. 醇类固定后的样品可以在-20 °C存放几个星期，若短时间可置于4 °C避光保存。

5. 上样速度不宜过快，细胞浓度不宜过高，一般低流速、200个细胞/秒为佳。

结果与分析

细胞周期的分析，以HeLa细胞为例，图1为固定细胞PI染色法，图2为活细胞Hoechst 33342染色法。首先用前向 (FSC) 和侧向 (SSC) 圈出细胞群，再用荧光通道的W (宽度)/A (面积)去除粘连细胞，最后用荧光通道的柱状图分析细胞周期。图中所标a、b和c分别代表G0/G1期细胞、S期细胞和G2/M期细胞。

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图1. 固定细胞PI染色法检测细胞周期

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图2. 活细胞Hoechst 33342染色法检测细胞周期

失败经验

染料浓度过高或过低或染色时间不够，都可能导致DNA的四倍体峰无法显示。

溶液配方

1. 磷酸缓冲液 (1× PBS) NaCl 8 g Na2HPO4 2.9 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g 溶于1 L ddH2O中 调整pH值为7.2~7.4，过滤灭菌，4 °C保存

2. 碘化丙啶 (PI) 溶液 2.5 mg PI溶于1 ml ddH2O中，4 °C保存

3. 核糖核酸酶 (RNase) 溶液 0.5 mg核糖核酸酶溶于0.5 ml 10 mM的Tris-HCl (PH 7.5) 中 100 °C加热15分钟 缓缓冷却至室温后分装成小份保存于-20 °C

4. Hoechst 33342溶液 10 mg Hoechst 33342溶于1 ml ddH2O中，4 °C保存

流式细胞术检测细胞凋亡 (Annexin V/PI法)

DOI:10.21769/BioProtoc.1010331

摘要：磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine，PS) 又称复合神经酸，位于正常细胞膜的胞质一侧，在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜胞质侧翻转到细胞膜外表面。基于此现象，利用Ca2 +依赖性Annexin V可与PS特异性结合，且亲和力高，适用于细胞凋亡早中期的检测。PI为一种核酸染色剂，与细胞核结合将细胞核染为红色。PI不可透过正常的细胞膜，可透过凋亡中晚期以及坏死细胞的细胞膜，适用于在排除细胞坏死的前提下细胞凋亡中晚期检测。将Annexin V与PI同时使用，通过分群表征出正常、坏死、凋亡和机械性损伤的细胞。在该实验中，我们对HeLa细胞的对照组和H2O2诱导组进行Annexin V/PI双标记，经流式细胞仪检测出不同特性的细胞群。

材料与试剂

1. 5 ml流式管 (Falcon，catalog number: 352008)

2. 15 ml离心管 (Falcon，catalog number: 352097)

3. HeLa细胞

4. Annexin V-Alexa Fluor™488 (Invitrogen，catalog number: A13201)

5. PI碘化丙啶 (Sigma-Aldrich，catalog number: P4170)

6. NaCl

7. Na2HPO4

8. KCl

9. KH2PO4

10. H2O2

11. DEME培养基

12. HEPES

13. CaCl2

14. PI染色工作液 (见溶液配方)

15. 1× Binding buffer (见溶液配方)

16. PBS (见溶液配方)

17. 800 μM H2O2 (见溶液配方)

仪器设备

1. 水平离心机 (BeckmanCoulter, model: Allegra X-12R)

2. 光学显微镜 (Olympus, model: IX73)

3. 流式细胞仪 (FACSFortessa)

实验步骤

1. 染色前处理

   1.1

   将收集到的细胞，用预冷1× PBS (4 °C) 重悬一次，300 × g , 离心5分钟，弃上清，收集细胞。

   1.2

   加入300 μl的1× Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度至1 × 106/ml。

2. Annexin V/PI染色

   2.1

   取流式管，按顺序编好空白管，单阳管和样本管号。流式管中分别加入经200目细胞过滤膜过滤好的100 μl细胞悬液，单阳管中分别加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488或10μl PI碘化丙啶轻轻混匀。

   2.2

   样本管加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488轻轻混匀；再加入10 μl PI碘化丙啶轻轻混匀。

   2.3

   室温避光孵育10~20分钟，加入400 μl 1× Binding Buffer，随后置于冰浴中，上机检测，所选通道如下： Alexa Fluor™488：488 nm激发，采集波段530/30； PI：561 nm激发，采集波段610/20。

结果与分析

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图1. 前向 (FSC) 和侧向 (SSC) 圈出HeLa细胞

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图2. Annexin V/PI双标记HeLa细胞凋亡检测

如图1所示通过前向 (FSC) 和侧向 (SSC)，分别圈出的对照组和H2O2诱导组的HeLa细胞范围有所差别。诱导凋亡组的细胞已呈现出分群的趋势。图2为Annexin V/PI双标记的结果，如图2A所示对照组的HeLa细胞处于正常状态，但也有少许凋亡晚期的细胞，原因是培养的HeLa细胞浓度过高，导致培养基里的营养消耗过快，少许细胞因饥饿发生凋亡。图2B中显示，经H2O2诱导HeLa细胞出现了显著的早期凋亡现象，比例由1.06%增至7.43%；凋亡晚期的细胞比例呈明显增长趋势。综上可知，双标记方法可以准确地反映凋亡过程：Annexin V标记的单阳性细胞为凋亡早期细胞；Annexin V 与PI双标记的双阳性细胞为凋亡晚期细胞 (Koç,等，2018)；PI标记的单阳性细胞为坏死细胞；两者均未标记上的双阴性细胞为活细胞。由此将凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、坏死细胞与正常细胞区别开。因此，可作为检测细胞凋亡的首选方法 (Schutte等，1998) 。

注意事项

1. 使用前低速离心，以免液体积存管盖和管壁。

2. 如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA：在标记前用1× PBS或 1× Binding buffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2+螯合，影响Annexin V的结合。

3. Annexin V-Alexa Fluor™488和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察。

4. 整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4 °C下操作，以免影响细胞状态。

5. 在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。

6. 为防止荧光衰变，宜在1小时内进行流式检测。

7. PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-Alexa Fluor™488染色，最短可在上机前5分钟再加入PI染色。

溶液配方

1. PBS NaCl 8 g Na2HPO4 2.9 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g 溶于1L ddH2O中，调pH值为7.2~7.4 过滤灭菌 4 °C保存

2. 800 μM H2O2 取30% H2O2 2 μl溶于880 μl 1× PBS中，配成20 mM的母液 再取80 μl母液溶于2 ml DEME培养基

3. PI染色工作液 1 mg/mL PI原液+无菌PBS按1:10稀释成100 μg/ml工作液 4 °C保存待用

4. 1× Binding buffer 10 mM HEPES 140 mM NaCl 2.4 mM CaCl2 pH 7.4

样本制备