脑转移(BrMs)是中枢神经系统(CNS)恶性肿瘤的主要组成部分，其中肺癌占所有脑转移的50%左右。一旦癌症扩散到大脑(肺癌晚期的常见事件)，治疗方案就非常有限，且BrMs患者的5年生存期< 5%。肿瘤微环境(TME)在促进癌细胞迁移和侵袭基底膜以启动转移，并促进癌细胞在转移部位的定植和生长方面起着至关重要的作用。脑转移位(或肿瘤支持的TME)的存在，维持了患者体内转移癌细胞的存活。鉴于BrMs高发率和高死亡率的普遍性，迫切需要确定患者分层的预后生物标志物，干预的治疗靶点，以及治疗反应的基因组和转录组相关性。然而，对脑转移相关分子和细胞基础的不完全了解，阻碍了相关临床难题的解决。
因此，为了了解非小细胞肺癌脑转移的转移机制，以指导预后和治疗，2022年10月 韦仕敦大学病理学和检验医学系Qi Zhang团队在《Nature Communications》（ IF= 17.694）杂志上发表题为“The spatial transcriptomic landscape of non-small cell lung cancer brain metastasis”的研究性论文（图1）。本文应用数字化空间分析技术（DSP），对44例非小细胞肺癌患者的原发性和转移性肿瘤标本进行空间全转录分析，用肿瘤核心、肿瘤免疫微环境(TIME)和肿瘤脑微环境(TBME)的形态学标记（PanCK：肿瘤上皮细胞、CD45：免疫细胞、GFAP：脑细胞）绘制完整的转移转录组图谱。研究表明，大脑中的肿瘤微环境(TME)，包括TIME和TBME的广泛重塑，为BrMs创建一个免疫抑制和纤维化的生态位。该研究除了对肺癌脑转移机制提供系统层面的见解外，还揭示了潜在的预后生物标志物，并建议根据BrMs的免疫和纤维化状态调整治疗策略。
图1
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研究亮点
对肿瘤bulk分析和传统的单细胞测序会导致肿瘤微环境中细胞位置信息的丢失，从而忽略肿瘤和TME的异质性。数字化空间分析技术（DSP）可以对肿瘤和TME进行空间表征。本文中，研究团队应用DSP数字空间全转录组（WTA，whole-transcriptome atlas）技术对一组NSCLC患者队列，绘制原发性和转移性肿瘤的转录组图谱，并对产生的空间转录组数据进行综合分析，为肺癌脑转移机制提供了重要的分子和细胞见解，对肺癌和脑恶性肿瘤的预后和治疗具有重要意义。
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研究思路
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研究结果
1.肺肿瘤和转移瘤的数字空间转录组学分析
44例脑转移的NSCLC患者的组织微阵列(TMAs) ，其中包含原发性肺癌(L)、转移性淋巴结(mLN)、脑转移 (LB)和肿瘤邻近脑组织(TBME)。7例非脑瘤患者的脑组织对照样本(BC)，进行空间转录组分析，以评估肿瘤内部的异质性。结果表明个体患者肿瘤脑微环境存在高度异质性（图2d,e）。
图2
2. 原发肿瘤和转移瘤的肿瘤微环境特征比较
研究者对原发肿瘤和转移瘤的肿瘤核心（L、LB）和TME（TIME-L/B和TBME）的细胞组成和丰度（肿瘤上皮细胞、免疫细胞、CAFs）等特征分别进行了比较，结果显示组织区域具有各自的细胞类群和丰度特征（图3a）。癌相关成纤维细胞(CAFs)和肿瘤间质在脑转移中起重要作用（图3b）。TME-L中的T细胞和B细胞明显多于TIME-B或TBME ，表明脑转移环境受到了免疫抑制(图 3c，d)。
图3
3. 与转移相关的功能基因的表达特征
研究者对肿瘤核心、TME的功能基因表达特征（Fges）、B细胞、MHC-1/2、CAF和ECM标志物比较以系统探究肺癌转移相关功能基因及介导脑微环境重塑的原因。结果显示TIME-L/B和TBME表达了更丰富的淋巴细胞、骨髓细胞以及促肿瘤细胞因子的Fges (图4a)。TME中富含CAFs、细胞外基质(ECM)和内皮细胞的Fges，表明纤维化和血管生成在肿瘤进展和转移中发挥重要作用。B细胞和MHC-1/2基因在TIME-L ROI中的表达高于TIME-B或TBME，表明抗原呈递和B细胞介导的免疫反应在脑转移环境中受到损害。TBME和BC之间CAF和ECM标志物的差异最为显著，在TIME-L/B 中也显著升高（图4a)，表明细胞外基质蛋白沉积和纤维化的增加在大脑中形成转移生态位中起着重要作用。
通过比较肿瘤核心区和TME区pEMT基因的表达水平，发现肿瘤核心区表达水平明显升高（图4b)，表明肿瘤内pEMT基因的表达升高与NSCLC脑转移有关。
图4
4. 纤维化是肿瘤脑微环境的关键特征，但与大脑受到免疫抑制无关
通过比较TBME和BC之间细胞水平和基因表达的差异以探究肺癌脑转移后纤维化的细胞分子基础。结果显示TBME中与大脑结构或功能有关的基因下调，而与纤维化相关的基因上调 (图5a和5b)。表明肿瘤邻近的大脑微环境增加了血管生成和纤维化，而减少了神经功能。Masson三色染色验证了TBME中成纤维细胞含量的增加与纤维化相关(图5c)。
基因集富集分析(GSEA)发现在纤维化中起关键作用的TGF-β信号通路基因显著增加，EMT、血管生成和缺氧的标志基因富集。CAF标记物TGF-β1 (TGFB1)、COL1A1和COL3A1以及许多ECM重塑基因均显著增加(图5d)。F(h) TBME中MRC1表达显著增加，提示巨噬细胞在促进纤维化中发挥积极作用。另外，一些细胞因子/生长因子和下游信号元件在TBME和BC之间或TBME的不同纤维组之间差异表达 (图5e)。F（h）和F（−）TBME之间比较说明，无论TBME 的纤维化状态如何，其适应性(即由 T细胞介导)和先天免疫(即由骨髓细胞介导)都受到损害（图5g,h）。
图5
5. 巨噬细胞-小胶质细胞轴的重编程塑造脑转移生态位
为了确定M1 / M2巨噬细胞极化在TBME中的作用，研究团队检查了关键的M1和M2标志物的表达。发现F（−）TBME的ROIs表达的M1标志物水平明显高于F（h）组，而M2标志物的情况则相反，表明F（h）TBME由M2型巨噬细胞主导（图6a）。此外，巨噬细胞发育和极化所必需的转录因子- SPI1，在F（h）TBME中存在着更高水平的表达（图6b)。M1/M2巨噬细胞标志物与TBME不同纤维状态的关联促使研究团队更系统地研究骨髓基因，TBME表达的骨髓特征基因明显多于BC，F（h）和F（I）/F（−）TBME组之间骨髓细胞的身份是不同的（图6c)。为了探索小胶质细胞在TBME中的作用，研究团队比较了TBME和BC之间以及高纤维和非纤维TBME之间的小胶质细胞特征基因的表达。在TBME内， F（h）和F（−）组之间观察到一些小胶质细胞特征基因的表达存在显著差异（图6d)。小胶质细胞特异性标志物在F（h）组中的表达水平明显较低，而参与吞噬作用或抗原呈递的标志物则显著上调（图6e)。所以，在TBME中，MDM-小胶质细胞轴经历了显着的重编程，因此驻留的小胶质细胞群体呈现出未成熟和炎症表型，而MDM群体在高度纤维的TBME中极化为M2型。
图6
6. TBME中星形胶质细胞和神经元的重编程
为了深入了解星形胶质细胞在塑造脑转移环境中的作用，研究团队研究了不同基TBME组中星形胶质细胞的标志性基因。与BC相比，F(h) TBME 的ROI显示许多星形胶质细胞特征基因的表达显著减少(图7a)。相比之下，F(−)TBME与BC之间的差异则不显著。
为了确定星形胶质细胞的功能差异，研究团队比较了成熟星形胶质细胞特征基因的表达。发现F(−)TBME和BC之间具有不同的基因表达模式，说明相应的星形胶质细胞之间的功能差异(图7b)。成熟的星形胶质细胞标志物，在F（−）TBME中显着降低，表明星形胶质细胞被重新编程以获得“不成熟”状态，可能赋予脑转移生态位更多的可塑性（图7c)。相对于F（−）TBME，在F（h）TBME中检测到几种成熟的星形胶质细胞基因的显著减少，这表明星形胶质细胞的生理功能受到纤维化更严重的损害（图7c)。
研究团队进一步比较TBME和BC之间以及TBME不同纤维组之间反应性星形胶质细胞特征基因的表达，来研究反应性星形胶质细胞是否有助于肿瘤脑微环境的重塑。研究发现反应性星形胶质细胞有助于形成纤维化的肿瘤脑微环境（图7e）。
图7
7. 基因关联网络分析揭示用于治疗靶向的TME模块
研究团队的空间转录组研究确定了在TBME (vs. BC)、TIME-B (vs. LB)和TIME-L (vs. L)中发现了数百个DEGs，并根据DEGs的共表达推断出相应的基因关联网络(图8a-c)。基因关联网络分析发现，TBME中CAF-ECM，免疫调节，和神经功能形成三个相互关联网络模块。并在这些网络模块和DEG分析中发现了许多潜在的治疗靶点，其中部分与DrugBank数据库中FDA批准的靶点一致（图8e)。许多靶点都有小分子抑制剂被批准用于临床，或目前正在进行癌症治疗的临床试验，这些抑制剂可能被用于BrMs的治疗。
图8
8. 转移的特征基因用以预测患者预后
为了确定转移的生物标志物，研究团队将当前的患者队列的肿瘤核心区分为快速转移（<10个月）或缓慢转移（>30个月）两组，并筛选L和TIME-L之间显著DEGs。发现快速和缓慢转移的L组之间有5个显著增加的基因和15个显著减少的基因（图9a)，这些基因中的大多数在肺腺癌（LUAD）样本队列（TCGA，n = 501）中，有>40%患者的表达改变。由于更快的脑转移通常与较差预后有关，研究团队想找出与转移相关的DEGs是否能预测患者的生存。事实上，转移特征基因集中的7个基因分别预测了当前队列和 LAUD 队列中患者的生存率（图9b)。对当前队列中20个转移特征基因进行Cox比例回归分析，产生了5个转移基因的协变量模型（图8c,d)，这 5个基因的某种表达模式与患者的不良生存期显著相关。为了确定BrMs的预后标志物，研究团队利用了在大脑TME（即TBME + TIME-B）网络中确定的DEGs，特别是在CAF-ECM和免疫调节模块中高度关联的节点基因。研究发现，TIMP-1单独或与CTSB一起在脑TME中的表达下降与患者的生存率呈负相关（图9e)。
图9
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文章总结
该研究利用数字化空间全转录组技术（DSP-WTA）对44例非小细胞肺癌患者的原发性和转移性肿瘤标本不同区域进行空间全转录组研究，研究表明，大脑中的肿瘤微环境(TME)，包括TIME和TBME，经历了广泛的重塑，为BrMs创建一个免疫抑制和纤维形成的生态位。该研究为了解肺癌脑转移的空间和功能异质性提供了一个框架，为探索非小细胞肺癌和某些脑恶性肿瘤的生物标志物提供了宝贵的资源，并为针对肿瘤微环境的分子靶向或免疫治疗的发展确定了许多治疗靶点。
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