接上一篇，继续介绍和NK细胞及ADCC相关的单抗。
单抗药物成为肿瘤治疗中的明星，很大程度上是因为它可以特异性识别肿瘤特有的表面抗原。单抗药物定向识别并攻击肿瘤细胞有几种机制：直接释放毒性分子攻击靶细胞，抑制靶细胞的增殖，去除免疫细胞的抑制信号，通过ADCC募集免疫细胞杀死靶细胞。一些新兴抗体，如双特异性抗体，通过连接靶细胞和NK细胞或T细胞发挥作用。文献（47/49/50）总结了更丰富的抗肿瘤的单抗。本篇集中讲述利用NK细胞介导的ADCC途径的抗肿瘤单抗，涉及到的单抗经临床前或者临床实验证明通过ADCC途径——至少是部分地通过ADCC途径发挥作用。
治疗黑色素瘤和神经母细胞瘤的抗GD2单抗
GD2，二唾液酸神经节苷脂，在人黑色素瘤和神经母细胞瘤细胞表达，而正常细胞很少表达，不失为单抗免疫治疗的理想靶标。
第一代的抗GD2抗体，3F8，是科学家1985年用鼠杂交瘤制备的鼠Ig3单抗。该单抗可触发针对人神经母细胞瘤的补体激活和ADCC作用。但早期临床中，大多数接受3F8单抗治疗的病人发生了对该抗体的排异反应（HAMA）。这导致大部分单抗被病人自身的抗体识别结合，加速治疗抗体在血液循环中的清除，从而降低了抗肿瘤的效果。
Mujoo等人在1987年独立合成的另一种鼠源抗GD2单抗，14.18，也表现出体外ADCC和体内的抗肿瘤效应。它的一个变异亚型，14.G2a，在临床实验中表现出抗肿瘤活性，不过，也有相当比例的病人表现出HAMA。效用被证实，接下来的挑战就是改善单抗骨架以提高效应、减轻免疫源性。
为降低HAMA应答、延长抗体在体内的半衰期，科学家构建了抗GD2杂合抗体：人源恒定区+鼠源可变区。由于杂合抗体有大量的“自己人”的表位，相对于完全来自鼠源的抗体，其免疫源性要低很多。Dinituximab（曾被称为ch14.18）就是这样一个杂合抗体，人IgG1和恒定区 + 鼠14.18单抗的抗GD2可变区。Dinituximab能够引发针对GD2阳性的神经母细胞瘤细胞的ADCC效应，体内实验也发现Dinituximab有明显的针对黑色素瘤的抗肿瘤活性。在已发表的I期临床数据中，该抗体显示没有明显的排异反应（HACA）。9个儿童病例中，4个有明显的抗肿瘤作用，1个有微弱的抗肿瘤作用。可见，改变抗体骨架获得了良好的临床效果。
为进一步改进抗体，科学家用老鼠的互补决定区（CDRs）嫁接得到了完全的人源抗体。该人源化抗体被认为比杂合抗体的免疫源性要更低。但是，即使是完全人源化的抗体，在治疗过程中，仍然发现了疼痛、毛细血管渗漏这样严重的毒副作用。毒副作用限制了药物的可用剂量，从而限制了药物的抗肿瘤活性。该毒副作用的发生推测来自抗体CH2结构域引发的补体激活。为了减少补体激活，科学家在人源化抗体CH2结构域的322位点进行了定点突变，结果补体激活降低了，药物的毒副作用也下降了，而该突变并不影响药物引发的ADCC作用，药物作用浓度因此可以提高，抗肿瘤效果也更明显。目前人源化的14.18K322A和人源化的3F8正在进行临床试验。
赫赛汀/曲妥珠单抗
曲妥珠单抗是一种人源化的抗HER2（人表皮生长因子受体/EGFR家族成员）单抗，用来治疗HER2阳性的乳腺癌以及其他过表达HER2的癌症。HER2是一种跨膜酪氨酸激酶，没有已知的配体，与其他EGFR家族成员形成二聚体即被激活，进而活化下游信号通路，从而促进细胞增殖和存活。相当数量的肿瘤细胞过表达HER2，而正常细胞HER2的表达却不高，因此HER2成了HER2阳性肿瘤治疗的理想靶点。
曲妥珠单抗于1998年被FDA批准用于治疗HER2阳性恶性乳腺癌症。除了阻止HER2形成二聚体，在体外实验中，曲妥珠单抗还能够介导ADCC杀伤HER2阳性细胞，其中发挥杀伤作用的就是表达有FcγR的NK细胞。使用乳腺癌动物模型的体内实验发现，经过改造失去FcγR结合能力的曲妥珠单抗突变体同时也丧失了抗肿瘤活性，这说明抗HER2单抗在体内的抗肿瘤活性与ADCC作用息息相关。此外，Clynes等人研究发现，曲妥珠单抗的抗肿瘤作用在活化型受体FcγRIIIA缺失的乳腺癌模型小鼠上会减弱，在抑制型受体FcγRIIB缺失的乳腺癌模型小鼠上会增强。这些实验数据表明Fc受体识别至少在一定程度上影响着曲妥珠单抗的抗肿瘤活性。
西妥昔单抗
西妥昔单抗是FDA批准的一个杂合单抗，用来治疗EGFR高表达的恶性结直肠癌（mCRC）、恶性非小细胞肺癌以及头颈部癌症。它可以结合EGFR，阻断EGF激活肿瘤增殖。体外实验表明，西妥昔单抗的部分抗肿瘤活性来自于其介导的ADCC，这个ADCC作用受到NK细胞不同亚型的FcγR以及配体的影响。此外，使用西妥昔单抗和伊立亚康联合用药的mCRC病人中，FcγR亲和力更高的病人的无进展生存期也更长。但在其他一些研究中，发现了相反的相关性，即FcγR亲和力更低的mCRC病人有更好的临床效果。不过，这些研究中的病人要么有着不同程度的KRAS突变，要么使用西妥昔单抗的同时接受了其他单抗的治疗，这说明病人基因谱以及治疗方案的选择对西妥昔单抗的应答效果都有影响。尽管如此，体外实验和部分临床实验数据还是支持西妥昔单抗介导的借助NK细胞的ADCC对该单抗的抗肿瘤活性意义重大。
利妥昔单抗和奥滨尤托珠单抗
利妥昔单抗是靶向于CD20（B细胞分化抗原）的杂合IgG1单抗。它的抗肿瘤效应包含多种机制：补体依赖的细胞毒性（CDC）、直接裂解细胞、抗体依赖的吞噬作用以及ADCC。B细胞淋巴瘤模型小鼠实验发现，利妥昔单抗的抗肿瘤效应在FcγR-/-阴性裸鼠或者FcγR封闭处理的老鼠身上都大为降低。有趣的是，Cartron等人的临床实验观察到NK细胞的FcγRIIIA在利妥昔单抗的抗肿瘤活性中起到非常重要的作用。他们的实验评估了滤泡性淋巴瘤病人的FcγRIIIA多态性对利妥昔单抗治疗的影响，并首次把更好的利妥昔单抗应答反应和高亲和FcγRIIIA基因型联系起来。不过，FcR基因型对利妥昔单抗临床应答的影响并不是那么简单。一些B细胞淋巴瘤实验组病人的临床结果与FcR基因型的关系就不明显。有很多因素会影响实验结果，包括病人群体、基因型分析方法、利妥昔单抗给药方案，以及病人是否同时在接受化疗等。
为了把单抗治疗中的ADCC效果最大化，科学家针对抗CD20 单抗和活化Fc受体的结合能力进行了改造。其中的一个手段就是抗体的糖基化改造，如使用过表达β-1,4-N乙酰-葡萄糖胺基转移酶III和高尔基α-甘露糖苷酶II的CHO细胞表达抗体，这些酶对抗体的修饰会帮助其结合FcγRIIIA（高亲和力、低亲和力亚型都适用）。第一代Fc糖基化改造的抗CD20人源化单抗，奥比尤托珠单抗，在体外实验表现出更强的ADCC以及直接杀伤靶细胞的作用，并且在淋巴瘤模型小鼠中表现出比利妥昔单抗更强的抗肿瘤活性。在对慢性淋巴细胞白血病病人的III期临床实验中，采用了奥比尤托珠单抗联合苯丁酸氮芥治疗方案的病人比利妥昔单抗联合苯丁酸氮芥治疗方案的病人表现出更长的无进展生存期。奥比尤托珠单抗单独治疗或者联合化疗治疗B细胞恶性肿瘤目前已经进入临床考察阶段。
如何增强ADCC的抗肿瘤作用
既然ADCC对单抗的抗肿瘤活性至关重要，增强效应细胞的免疫活性就成了增强单抗ADCC活性理想的联合治疗手段。NK细胞除了直接参与ADCC，还会通过释放细胞因子（如IFNγ）激活其他免疫过程，从而启动额外的免疫应答来攻击靶细胞。
单抗+放射线治疗
大约有60%的癌症患者会接受放射线治疗。放射线可以通过DNA损伤启动抗肿瘤效应，同时还会增加肿瘤细胞对免疫应答的敏感性。所以，免疫应答可以调节放射线的作用，反之，放射线的作用也会增强免疫治疗的效果。放射线与免疫系统相互作用的机制包括放射线会诱导：
生成炎症因子
释放肿瘤特异性抗原
肿瘤细胞表达免疫敏感性marker
增强血管生成以加强免疫监督
其中第三个机制肿瘤细胞表型的改变包括放射线诱导的MHC I、NKG2D配体、Fas死亡受体的表达上调，所有这些都会增强ADCC应答。此外，放射线还会影响肿瘤特异性抗体靶向的抗原的表达，而体外实验已经证明这种表达会强化ADCC应答。还没有体内实验能够证明放射线和ADCC的相互作用。有趣的是，那些使用了能够引发ADCC的肿瘤特异性抗体（包括西妥昔单抗、曲妥珠单抗以及Dinituximab）的病人往往也接受了放射线治疗。关于单抗+放疗治疗方案中ADCC和NK细胞对临床应答的作用还没有明确报道。
单抗+基质金属蛋白酶抑制剂
NK细胞活化过程中，细胞膜上将不再表达FcγRIIIA（CD16），该过程由基质金属蛋白酶（MMPs）来调节。体外实验中，用MMPs抑制剂（GM6001）处理NK细胞，可以减少K562肿瘤细胞激活的FcγRIIIA消失，但却不干扰NK细胞的脱颗粒，这说明FcγRIIIA的消失和NK细胞的脱颗粒是受不同通路调控的。我们有理由相信，在不影响NK细胞脱颗粒的前提下，使用MMPs抑制剂可以维持FcγRIIIA表达能够增强NK细胞的ADCC作用。目前，Romee等人发现了一种特异性的MMP，ADAM17，是NK细胞活化过程中关闭FcγRIIIA表达的主要蛋白酶。他们研究发现，一种ADAM17特异性抑制剂不仅可以避免肿瘤靶标激活的FcγRIIIA消失，在肿瘤特异性单抗存在的情况下，还能够增强NK细胞的脱颗粒作用以及促进IFNγ的生成。这些体外实验证明，限制细胞表面FcγRIIIA的减少能够增强NK细胞介导的ADCC，单抗连用MMPs抑制剂很可能促进ADCC，为肿瘤免疫治疗提供了新的可能性。
抗GD2单抗+ IL2 + GM-CSF
抗GD2单抗本身在神经母细胞瘤病人的治疗过程中即表现出一定的抗肿瘤活性，在联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白介素2（IL2）共同作用时，可以进一步激活免疫效应细胞，其临床抗肿瘤活性会更好。我们实验室（原作者）以前的研究发现，从没有接受过IL2治疗的癌症病人体内提取的外周血单核细胞（PBMCs），即使联合使用抗GD2单抗和IL2，针对神经母细胞瘤细胞的ADCC作用水平也很低。但是，相同的病人在经过4个星期的IL2注射治疗后，提取得到的PBMCs针对神经母细胞瘤细胞表现出明显提高的抗GD2单抗介导的ADCC水平，额外加入了IL2后，ADCC水平还会再上一个台阶。这些数据表明，体外注射IL2可以解决部分病人的免疫抑制问题；从经过IL2治疗的病人体内提取的NK细胞，在体外实验中联合抗GD2单抗和IL2可以表现出很强的针对神经母细胞瘤的ADCC作用。
除了IL2，GM-CSF也可以作为免疫激活剂，特别是在化疗之后出现免疫抑制，用来改善骨髓髓系功能。GM-CS和鼠源抗GD2单抗（3F8）的联用，可以实现GD2阳性癌症病人的完全应答，这一效应尤其在那些存在MRD（minimal residual desease）的病人中十分重要。在一项针对诱导治疗/自体移植治疗后的高危神经母细胞瘤病人的III期临床实验中，病人被随机分成两组，一组接受常规的他扎罗汀治疗，另一组采用了他扎罗汀+ dinituximab + IL2 + GM-CSF的免疫治疗方案。和常规治疗组相比，免疫治疗组病人的无事件生存期和整体生存期都明显延长了。其他一些单抗，如利妥昔单抗和曲妥珠单抗等，也在尝试联合IL-2的临床方案，以期更好的抗肿瘤效果。
单抗+IL15
IL15是另一种可以激活免疫细胞如NK细胞、T细胞的细胞因子。IL15受体（IL15R）和IL2受体有一样的β链和γ链，只有α链特异性识别IL15并将IL15提呈给免疫细胞的β/γ受体。体外实验显示，可溶性的IL15可以活化NK细胞，增强NK介导的毒性作用，增强NK细胞分泌细胞因子；使用了重组人IL15之后的癌症病人体内也表现出IL15导致的NK细胞增殖和活化。不像IL2会引起T调节细胞(Treg) 维持从而降低免疫应答的活化，IL15不激活Tregs。而且，相对于IL2临床前模型试验中表现出的强毒副作用而言，IL15不触发T细胞活化后的死亡，也不引起血管渗漏综合征（VLS）。由此可以看出，IL15很有潜力代替IL2在联合单抗作用过程中提高NK细胞介导的ADCC作用。
事实上，Caligiuri团队确实报道了IL15辅助增强的NK细胞介导的ADCC作用。近来，Moga等人进行的体外实验也表明，IL15激活的PBMC能够显著增强针对B细胞淋巴瘤的利妥昔单抗介导的ADCC作用，该过程的主要效应细胞是NK细胞。该实验使用的细胞株为从急性淋巴细胞白血病（CLL）病人分离得到的CLL细胞株。此外，他们还发现，在低亲和力和高亲和力FcγRIIIA的病人个体中，IL15引起的ADCC水平的增强是类似的。这些研究表明，IL15对不同亲和力FcγRIIIA介导的ADCC水平的提高都有作用。即，IL15可以弥补因FcγRIIIA亚型不同导致的单抗治疗效果差异。
和IL2不同，IL-15依靠特异性表达的IL15α链激活NK细胞和T细胞，而不是与IL2 相同的β链/γ链。为了提高IL15的活性，科学家么设计了几种IL15的类似物，并进行临床前筛选实验。其中一种IL15α受体“寿司”结构域与人IL15的融合体（RLI）在体内体外实验中都表现出不错的活性。此外，一种可以刺激表达IL15受体细胞增殖的IL15的突变体也被发现。不久之后，该团队还表达了该突变体和IL15Rα/Fc的融合蛋白。这种IL15的超级类似物，ALT-803，在针对B细胞淋巴瘤的体内和体外实验中，都表现出增强利妥昔单抗介导的ADCC作用。综上，IL15和抗肿瘤特异性单抗的治疗方案具有很高的临床价值，目前NCT02384954正在进行临床研究。
待续……
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