m6A甲基化作为研究的热点，目前有很多的研究方向，其研究领域涉及生长发育的方方面面。如果想选RNA甲基化作为方向设计课题，可以从哪些方面着手？今天的文章围绕m6A甲基化的整体研究思路展开，探讨m6A相关调节蛋白分析、m6A+免疫浸润、m6A预后风险模型这三个经典思路，全程干货！
m6A相关调节蛋白分析
m6A甲基化研究无非是围绕着甲基化转移酶(Writers)、去甲基化酶(Erasers)和甲基化阅读蛋白(Readers)这三大组分展开相应的研究,最为典型的研究就是从m6A修饰相关调控蛋白入手，深入阐明m6A修饰生物学功能和作用机制，一般套路为由甲基化转移酶/去甲基化酶/阅读蛋白差异，到研究靶基因修饰变化，再到靶基因的mRNA和蛋白质表达变化，得出m6A修饰相关调控蛋白通过介导相关基因异常影响细胞表型和功能特征。
下面我们通过一篇在Journal of Hematology & Oncology （IF=17.388）的文章对其研究思路进行解析吧。
研究思路：
1、从m6A修饰相关调控蛋白(甲基化酶、去甲基化酶和阅读蛋白)入手，发现某个蛋白差异，做敲低/过表达该蛋白，肿瘤恶性生物学表型改变。
1.1 找到其中胶质瘤中存在显著差异表达m6A修饰相关调控蛋白，在mRNA和蛋白水平均证实RNA m6A阅读蛋白YTHDF2表达水平与胶质瘤级别升高、预后不良显著正相关。
1.2 通过鉴定了与 YTHDF2 表达正相关的基因，探索 YTHDF2 表达对神经胶质瘤功能的潜在影响。进行功能富集分析，发现重叠基因富含恶性肿瘤相关的生物过程，包括细胞周期、RNA 代谢和细胞周期相变。
1.3 敲低或过表达YTHDF2的表达，发现其细胞增殖和迁移能力减弱或增强。证实YTHDF2表达水平升高可促进胶质瘤恶性生物学表型。
2、探索m6A修饰相关调控蛋白在胶质瘤中致癌作用的潜在途径，向下游找靶标，寻找调控下游的通路或蛋白，根据m6A修饰相关调控蛋白在m6A修饰的作用，进一步探索其致癌机制。
2.1 寻找与 YTHDF2 表达正相关的基因的富集途径和免疫染色发现NF-κB 信号传导是最显着的富集途径，并在敲低YTHDF2的表达时发现NF-κB（p65）的核分布降低。
2.2 由于YTHDF2 最明显的作用是阅读 m6A 修饰加速 mRNA 衰减，假设 YTHDF2 可能通过降解负调节 NF-κB 的基因的 RNA 来激活 NF-κB。通过GO term 和文献收集76 个负调节 NF-κB 信号通路的基因。通过富集分析和相关性检验确定YTHDF2 对 NF-κB 负调节的靶标--- UBXN1。
2.3 通过敲低或过表达YTHDF2的表达，可以看到UBXN1 的mRNA和蛋白质表达上调以及磷酸化-NF-κB（pp65）降低。表明 YTHDF2 上调可以通过抑制 UBXN1 表达来诱导 NF-κB 活化。
3、探究靶标上存在m6A修饰相关调控蛋白阅读的m6A修饰位点，并证明该修饰位点介导的m6A修饰引起靶标 RNA分子的功能变化。
3.1 通过MeRIP 测序及检查表观转录目标数据库，发现UBXN1 mRNA 3'端周围的 m6A 修饰位点有可能被 YTHDF2 阅读.
3.2 又由于METTL3的表达决定了胶质瘤中 RNA 的 m6A 修饰水平，对有或没有 METTL3 敲低的 U87 细胞进行了 MeRIP 测序和RIP-PCR 实验，UBXN1 mRNA 上存在 METTL3 介导的 m6A 修饰位点，它们有可能被胶质瘤细胞中的 YTHDF2 阅读。
3.3 进一步研究发现，由METTL3介导的UBXN1 mRNA 3’端m6A修饰水平可调控YTHDF2对UBXN1 mRNA的阅读，并导致UBXN1 mRNA的衰减。
4、进一步证实m6A修饰相关调控蛋白对胶质瘤恶性表型的影响的分子机制。
4.1 通过过表达 YTHDF2 的细胞中过表达 UBXN1，进行CCK-8 测定、transwell 分析和蛋白质印迹均表明UBXN1 过表达逆转了 YTHDF2 对肿瘤恶性表型和 NF-κB 激活的影响。
4.2 通过表达空载体、YTHDF2 过表达载体或 METTL3 过表达载体的荧光素酶标记的 U87 细胞注射到裸鼠的大脑中，证明了YTHDF2通过阅读METTL3介导的m6A修饰来促进UXBN1 mRNA降解，从而激活NF-κB信号通路来促进肿瘤恶性进展的新机制。
m6A + 免疫浸润
接下来的研究中不再局限于单一的m6A调控蛋白的调控机制，而是聚焦于多个调控蛋白之间是免疫浸润的关系。一般思路为m6A调节因子聚类---免疫浸润亚型分析---m6A和免疫细胞的相关性分析---构建预后风险模型。
通过一篇发自Artificial Cells Nanomedicine and Biotechnology（IF=5.678）上的研究来解析其研究思路吧。作者系统地研究了前列腺癌中重要的m6A调节因子与免疫浸润的相关性。
研究思路
1、分析前列腺癌和正常样本间m6A甲基化调节因子的表达差异。
1.1 首先确定了24个m6A调节因子，包括9个writers、2个earsers和13个readers，通过TCGA 和 GEO 数据库获得其表达水平。
1.2 热图和箱线图了解肿瘤和正常样本之间的差异。
1.3 整合体细胞突变和拷贝数变异（CNV）数据确定了前列腺癌中m6A调节因子的突变率。
2、研究各个m6A调节因子的表达与前列腺癌标志相关通路活性之间的相关性
2.1 使用 m6A 调节器网络描绘了 m6A 调节器相互作用、前列腺癌患者调节器连接的综合景观，并绘制其相关图。
2.2 采用富集分析探索m6A调节剂的生物学功能。
2.3 研究writers、earsers和readers的调节器之间的串扰在不同m6A 修饰模式的形成下的作用。
3、研究m6A 调节因子对前列腺癌免疫微环境的影响
3.1 tossGSEA 分析评估每个基因组的免疫浸润水平并将患者分为两个免疫组。
3.2 研究高、低免疫浸润组的 TME 评分（免疫评分、估计评分、基质评分、肿瘤纯度）差异在 TCGA 数据库中是否具有统计学意义。
3.3 评估了免疫浸润簇与临床预后特征之间的关联。
3.4 研究免疫浸润簇之间 m6A 调节因子表达的是否存在显着差异。
4、前列腺癌中m6A 调节因子的一致性聚类
4.1 对前列腺癌队列中24 个 m6A 调节因子的无监督聚类，将m6A 调节因子分为4簇，其中采用主成分分析 (PCA) 以便更好的划分簇 4 和其他簇。
4.2 采用Kaplan-Meier 证明四个集群之间的预后存在显着差异。
4.3 热图表明不同簇中的 29 个免疫相关基因特征，并计算四个簇之间m6A基因表达的差异。结果表明m6A无监督聚类与 TME 相关。
5、m6A RNA甲基化调节因子的预后特征构建，与免疫相关基因的预后评分风险分析
5.1 为了研究这 24 个 m6A 基因在前列腺癌中的预后价值，构建单变量 cox 生存回归分析，紧接着采用lasso回归模型构建风险预测模型。
5.2 根据risk-score 划分高风险组和低风险组，通过热图表明高风险组和低风险组存在显著差异。
5.3 评估模型。Kaplan-Meier和ROC曲线验证诊断和预后价值。
5.4 通过热图研究风险预测模型中的 29 个免疫相关基因特征，结果显示24个m6A调节因子构建的风险预测模型与TME显着相关。
5.5 多种类型的免疫细胞浸润分析。研究了 22 个免疫细胞亚群中前列腺癌和正常组织中免疫浸润的差异。通过小提琴图对三个免疫浸润簇（高、中、低）中22种免疫细胞表型的差异进行可视化，结果表明16 个免疫细胞在三个簇之间呈现差异表达谱。紧接着前列腺癌患者的 m6A 调节因子的无监督聚类和lasso回归风险预测模型中的免疫浸润特征，结果发现六个免疫细胞在四个m6A簇之间呈现差异表达谱。
风险模型
构建预后风险模型可以说是研究癌症的一个非常经典的套路了，下面这篇发自Molecular Therapy-Nucleic Acids（IF：8.886）的文章对构建了基于 m6A 的 lncRNA 的风险模型，用于预测肺腺癌患者的预后和免疫治疗效果。
研究思路：
1、获取数据。从TCGA数据集中提取了 14,142 个 lncRNA 和 21 个 m6A 基因的表达谱。
2、探索数据。采用Pearson 相关分析绘制相关图以鉴定了 m6A 相关的 lncRNA，得到1149个m6A相关IncRNA。最后桑基图可视化用以描述m6A-lncRNA 共表达网络。
3、构建风险模型。
3.1 变量筛选。采用单变量Cox回归分析从TCGA数据集中1149个m6A相关IncRNA中筛选出38个m6A相关预后lncRNA，紧接着采用LASSO-penalized Cox 分析进一步筛选，筛选出24个m6A相关的lncRNA。
3.2 构建风险模型。使用多变量 Cox 比率风险回归分析来区分自发性预后蛋白。12 种 m6A 相关 lncRNA 是与训练集中的 OS 独立相关的预后蛋白，用于构建风险模型以评估 LUAD 患者的预后风险。
3.3 风险分级。根据预后风险等级的中值，将 LUAD 样本分为低风险组和高风险组。绘制两个不同风险组患者的生存状态和生存时间，并采用热图进行聚类分析显示了每个患者的 12 个预后 lncRNA。
3.4 验证模型的预后能力。获取外部数据，分为训练集和测试集，训练集用以构建风险模型，对于测试集进行Kaplan-Meier 生存分析，以验证与训练集结果是否存在差异，与此同时，为进一步预测预后模型的能力，探索了无病间隔（DFI）、无进展间隔（PFI）和疾病特异性生存（DSS）以区分高危和低危 LUAD 患者。
3.5 验证风险模型分组能力。采用PCA基于整个基因表达谱、21个m6A基因、12个m6A相关lncRNA以及根据12个m6A相关lncRNA的表达谱分类的风险模型，测试低风险组和高风险组之间的差异。
4、验证风险模型的临床效果。
4.1 验证两个分组在免疫指标的表达。基于m6A 相关 lncRNA 模型分别对低风险组和高风险组分析在免疫指标的表达是否差异。
4.2 用基因本体 (GO) 富集分析探索基于 m6A 的模型的潜在分子机制。
4.3 研究了 m6A 相关的 lncRNA 模型与免疫治疗生物标志物之间的相关性。
4.4 对突变数据根据变异效应预测因子对突变进行分层。测试了 m6A 相关的 lncRNA 模型相比于 TP53 突变状态的预后效果。
5、鉴定风险模型治疗LUAD 患者的潜在药物。
使用pRRophetic 算法根据每个样本的癌症药物敏感性基因组学 (GDSC) 数据库中可用的半数最大抑制浓度 (IC50) 来估计治疗反应。
6、构建并评估预后列线图模型将模型结果可视化。
整篇文章作者针对LUAD 患者，辅助m6A+ IncRNA+免疫治疗的研究，癌症+m6A+免疫治疗几大热门领域，构建m6A相关IncRNA风险模型，操作简单容易复现，再加上严谨的实验论证，发表高分文章自然水到渠成。
总结
以上是m6A的基本研究思路，再加上严谨的实验论证，要想发表文章自然水到渠成，当然其中还需要明确细化更多的问题。
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