前期文章：
- 我们用两篇文章的篇幅大概讲了一遍质粒骨架及其各个要素的介绍：
解剖式学习一个质粒结构--update
质粒系列之什么是质粒 - 再谈了最传统的限制性克隆：
质粒系列之限制性克隆--restriction cloning - 前面还夹杂的讲过一些piggybac、gateway、RMCE的一些内容：
基因编辑如何换药不换汤 -
慢病毒系列也有讲过两篇：
团队作案HEK293，史上最强搬砖细胞
不想再用慢病毒了，我还有什么别的选择吗？piggyBac transposon - 此外我们本还有一个CRISPR screening的专题，只有开头，未得完善：精准大海捞针--5. CRISPR screening专题
- 质粒系列之再谈无缝连接--Gibson assembly
- Golden Gate，质粒改造的王者
- 关于CRISPR-Cas9技术的脱靶效应：CRISPR-Cas9基因编辑--脱靶效应如何检测
在将CRISPR脱靶效应时，我们在文末提到CRISPR编辑效率与P53状态之间的关系，同时Cas9稳定表达可能会对细胞造成影响，从而增加CRISPR-Cas9的应用风险。不禁会有疑问：为何要将CRISPR与P53联系在一起？
1. DNA损伤和P53 response
我们首先要了解DNA损伤与P53之间的关系，如下图：
DNA damage and P53 response
由上图可见：
左上角：电离辐射（IR）等引起的DNA双链断裂（DSB），可经由ATM信号从而激活P53；
右上角：UV等引起的DNA单链断裂或损伤，可经由ATR信号，激活P53。
可见几乎任何一种DNA损伤都会导向至P53反应。而我们不止一次强调，CRISPR-Cas9的上半部分是引起DNA双链断裂（DSB），之后通过不同的修复方式达到精准基因编辑（HDR，MMEJ）或移码突变（NHEJ）。于是，CRISPR作为一种可造成DNA”损伤“的技术，该技术的应用不可避免的引起P53反应。
但，P53反应和CRISPR技术应用隐患有何关系？
2. P53的功能
接着，我们可以简单来看看P53在生命体中到底有何作用。
抑癌基因：TP53（tumor suppressor protein）可以说只知名程度最高的抑癌基因之一（甚至可以说是第一）。在大部分肿瘤中都可检测到TP53突变，同时肿瘤细胞又常常表现出基因组紊乱的现象。因此，人们推测TP53的突变与肿瘤发生有关。随后有大量的动物实验和临床研究表明，TP53在体细胞突变引起的肿瘤中高度突变，同时germline TP53突变的病人也常会罹患一种甚至多种肿瘤疾病。
基因卫士：TP53作为DNA损伤的反应机制，在正常情况下P53蛋白由于MDM2的泛素化从而被快速降解，因此属于不稳定状态。而当DNA损伤出现时，MDM2被磷酸化从而失去泛素化P53的功能，P53的表达迅速增加。而P53作为一种转录因子，迅速调控下游的各项指标。当DNA损伤较轻时，P53会介导细胞周期阻滞，从而给予细胞DNA修复的机会，经过修复后的细胞可再次进入细胞周期。而当DNA损伤十分严重无法修饰时，P53会将引导细胞走向凋亡，从而避免不良DNA损伤传递给子代。因而，TP53因其维持基因组稳定性的作用，达到抑癌的效果。
其他：P53的内容十分繁多，如P53在肿瘤中的变化大多是错义突变而非缺失，突变的部分大多在DNA binding domain，导致P53功能缺失的突变我们叫“loss of function, LOF”。而有一部分P53突变会产生突变体，该突变体不仅抑制剩余的野生型的P53的功能，同时自身还拥有新的功能，此时我们称之为“gain of function, GOF”，这时候的P53突变体可被称为oncogene。此外，如P53不仅仅在肿瘤细胞中有突变，其实在正常体细胞中也常检测到突变，有前两年有一篇文章详细介绍了这部分内容，并提出紫外线等是P53突变的主要原因之一，所以小伙伴们，防晒搞起来噻！
综上所述，P53作为一个维持人体基因组稳定性的重要基因，如果CRISPR技术打断了TP53的功能，那么其后果将相当严重。
3. 文献解读：P53抑制CRISPR-Cas9编辑
第一篇文章发便于2018年七月份的Nature Medicine，从标题上很明显看出内容为，P53可抑制CRISPR-Caas9在人多功能干细胞上的应用。
paper 1
1. 背景和科学问题：起初人们发现在干细胞上进行基因编辑的效率总是很低。
2. 目的和解决办法：为了提高CRISPR编辑效率，作者通过以下两种方式达成高达80%的基因编辑效率：
（1) 构建Cas9稳定表达的人多功能干细胞（human pluripotent stem cell，hPSC）
如下图所示，作者将一个双Tet-On 3G的Cas9及其筛选标记元件插入到AAVS1位点，改系统可控制Cas9表达的时间。同时sgRNA投放方式为慢病毒稳转。
Tet-On 3G
(2) 瞬转Cas9-ribonucleoproteins (RNPs)
<u>当作者提高基因编辑效率后，发现有不少人多功能干细胞在基因编辑后死亡，这就引起了作者的好奇：缘何死亡，机制为何？</u>因此他们设计了以下实验并最终找到了原因。
3. 实验设计和主要结果：
3.1 CRISPR-Cas9可导致人多功能干细胞（hPSC）死亡
在以往研究中，由于基因编辑效率很低，因此没有观测到CRISPR明显的细胞毒性。而当作者将编辑效率增加至80%以上以后，观测到了明显的细胞毒性现象。如下图所示，（e）在图e中，通过四环素诱导Cas9表达，并结合sgRNA对MAPT基因进行编辑。MAPT基因并不是人多能干细胞生存所必须的基因，换言之，敲除该基因不应该对细胞的生存造成影响。而结果却显示，对MAPT基因编辑的同时，细胞团块缩小，证明有大量细胞死亡。（h）在图h中，一样观测到了类似的现象。当然还有很多其他证据支持，最终文章的结论为，CRISPR-Cas9基因编辑会导致hPSC细胞的死亡。<u>那么CRISPR-Cas9基因编辑导致细胞死亡的原因到底为何？</u>
design
3.2 CRISPR-Cas9诱导人多功能干细胞（hPSC）死亡与Cas9造成的DSB相关
为了验证CRISPR-Cas9诱导人多功能干细胞（hPSC）与Cas9诱导的DSB之间的no bias关系，而非特定基因编辑导致的死亡。作者对hPSC进行CRISPR文库筛选，通过查看CRISPR文库内的sgRNA分布变化查看CRISPR-Cas9与hPSC死亡的关系。
注意：下图中出现的ddCas9是Cas9的一种变体，当没有Shield1的时候，ddCas9蛋白降解，无法行使其功能，只有在Shield1存在时ddCas9才能稳定行使功能。
如下图c-d所示：（1）在没有基因编辑发生的H1，iCas9+Dox组中，无论是target到目的基因的sgRNA还是没有target gene的sgRNA，在12天的筛选之后都没有出现sgRNA分布的差异。（2）当外加Dox诱导Cas9表达，或者外加Shield1诱导ddCas9稳定之后，CRISPR-Cas9基因编辑的发生导致了有target的sgRNA分布出现了差异，证明有 一部分targeting sgRNA转染细胞已经在基因编辑过程中死亡。同时non-targeting sgRNA比例的增加，反向证实了一部分targeting sgRNA转染细胞的消失。以上结果证明了全基因组性的基因编辑导致细胞死亡，其原因可能是Cas9导致的基因毒性，而非特定的基因缺失导致的死亡。
而图e结果表示，这种对于CRISPR-Cas9毒性的敏感性主要表现在干细胞中，而常见的工具细胞和肿瘤细胞并没有这种现象。
design2
stem cell are more sensitive to CRISPR-Cas9 induce cytotoxicity
3.3 P53参与 CRISPR-Cas9诱导人多功能干细胞（hPSC）死亡过程
以上结果虽证实了CRISPR-Cas9编辑过程造成hPSC死亡的因果关系，但没办法把P53牵扯进来。思路很简单，就把前面做的MAPT gene editing的细胞送RNA-seq，看一下差异基因（左图a）。差异基因自然有许多，但P21作为P53的下游赫然在列，而且变化倍数非常大。当然为了排除MAPT基因的影响，还对其他基因编辑细胞进行了P21表达鉴定(右图d-g)，进一步证实P21的变化，而P53作为P21的直接上游，应也是参与了这个过程。
p21 change
3.4 P53突变可逆转CRISPR-Cas9 induce DSB导致的hPSC死亡
上述所有结果都只是证明了P53与CRISPR-Cas9诱导的hPSC死亡相关，但还是不能证明P53是hPSC在CRISPR-Cas9基因编辑过程中死亡的原因。因此作者构建了一个P53 mutant pool，这个pool中有一半以下是P53WT的细胞，一半以上是P53 mutant的细胞。可以看到左图（c）中显示：（1）在control pool中激活CRISPR-Cas9基因编辑，细胞的融合度不断下降，证明有细胞死亡；（2）而在P53 mutant pool中，CRISPR-Cas9的激活，虽相对未激活组（P53 mutant pool -Dox），其融合度有所下降，但融合度相对 control+Dox组有所上调。我们分析可知，融合度下降的原因在于P53WT细胞的死亡，而融合度上升则在于P53 mutant细胞的死亡抵抗。右图（e）中通过外加P53DD抑制野生型P53功能，细胞团块得到生长。
P53 involved
<u>以上结果均表明，在P53功能失活之后，CRISPR-Cas9介导的死亡被抑制，因此证明了P53是CRISPR-Cas9介导hPSC死亡的原因。</u>
4. 小结
作者切入点看起来很简单，但却也很巧妙。CRISPR-Cas9作为诱导DSB的因素，常理来说一定会诱导P53的激活，而P53激活则会介导下游相关功能的体现（细胞周期阻滞、细胞衰老甚至死亡），这是一个很清晰明了的思路，但我们很多人都没有想过。且据我们经验，人多功能干细胞常规的P53-P21表达水平非常低，WB和免疫荧光几乎无法检测到。但该类细胞对外界刺激非常敏感，如人胚胎干细胞只需要给予1-2 Gy的X光即可造成死亡。而成纤维细胞、间充质干细胞或者肿瘤细胞，给予10-30 Gy X光还无动于衷。由此可见，人多功能干细胞对DSB激活P53更为敏感，更易死亡。正是因为这种敏感的机制，才能使得人多功能干细胞的基因组一直比别的细胞更为稳定。虽然人多功能干细胞更为敏感，但不代表这种机制在其他常见细胞中不会发生。
由于P53 WT细胞可应对CRISPR-Cas9诱导的DSB，更易死亡，而P53 mutant细胞可以抵抗.。因此CRISPR-Cas9则成为了一个P53 mutant细胞的筛选因子，长此以往，细胞群落中P53 mutant的比例越来越高，其风险不言而喻。
这篇文章我在19年初就已读过，以为文章解读会写得比较容易，但当提笔写的时候发现有很多细节当时根本没有注意。比如这篇文章纯熟的运用了CRISPR技术的多种手段，从普通敲除到inducible knockout，而且它的inducible还有多种方式（Cas9的诱导表达，Cas9的诱导稳定以及Cas9的诱导失活）；从单个基因的验证到全基因组的文库筛选。因此我觉得这篇文章不仅仅是阐明CRISPR技术的应用风险一篇重要文章，同时也是我们全面学习CIRSPR技术的良好案例。文章非常棒， 值得回到原文好好细读。
本来这次推文还想解读两篇文献，考虑到篇幅只能将另一篇文献放在下一篇文章中了。写的时候还担心写简单了不够深入、写复杂了太过枯燥，内容是一展再展又一删再删。希望经过整修之后，内容不那么枯燥，还能有所帮助，感谢阅读并期回馈交流~
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