基因课FTP地址：ftp://http://gsx.genek.tv/2020-3-10%E7%9B%B4%E6%92%AD%E4%B8%80%E4%B8%AA%E5%AE%8C%E6%95%B4%E7%9A%84%E8%BD%AC%E5%BD%95%E7%BB%84%E9%A1%B9%E7%9B%AE/
听张旭东老师的课

准备

• 在linux下就能做
• 差异表达分析是在组之间做的，即一个基因在组间的差异大于其在组内的差异，则此基因为差异表达基因
• conda安装很多时候不稳定
• 软件
  DESeq2
  • 安装：
    R脚本运行 BiocManager::install('DESeq2')
    或 conda安装 conda install bioconductor-deseq2

edgeR

• 安装：
  R脚本运行 BiocManager::install('edgeR')
  或 conda安装 conda install bioconductor-edger
• edgeR可以做无生物学重复的测序数据的差异表达分析(只做组间差异表达分析),需要用--dispersion参数指定组内差异值，方法是查阅文献看别人类似领域组内差异大概是多少，或者盲猜是0.1，不行就再调整

voom

ROTS

• 差异表达分析perl脚本
  run_DE_analysis.pl

输入文件

• gene.counts.matrix文件
• 样本信息表
  sample.txt
  内容(分隔符为‘\t’)：
  • 单末端数据：第一列-分组名称，第二列-样本名称，第三列-序列绝对路径
  • PE数据：除前三列外，加第四列，为PE第二条序列的绝对路径

只用得上前两列

• 比对设计文件,用于指定分组，默认是所有的两两之间的比
  contrasts.txt文件
  内容(分隔符\t):
  • KID_S1 BLO_S1
    KID_S4 BLO_S4
    每行指定要差异表达分析的两组数据

分析

• run_DE_analysis.pl的perl脚本在软件包trinity的目录下
  目录为miniconda3下(或anaconda) opt/trinity-2.1.1/Analysis/DifferentialExpression/run_DE_analysis.pl
  trinty是一个用于无参转录组组装的软件，可以用conda安装
• commands
  perl run_DE_analysis.pl
  --matrix gene.counts.matrix \ # 指定counts矩阵
  --method DESeq2 \ # 指定差异表达软件
  --samples_file sample.txt \ # 指定样本信息表
  --contrasts contrasts.txt # 如果需要，指定本次需要比较的样本

输出结果

• 生成一个.dir新目录存放结果
• .Rscript为perl生成的差异表达分析的R语言脚本
• .DE_results为差异表达分析结果文件，表格，内容有id(基因ID), baseMean & A & B(平均值，不用管), log2FoldChange(差异的倍数,基础条件为>1), lfcSE, stat, pvalue, padj(矫正后Pvalue,基础条件为<0.05)

结果筛选

• sed去除文件第一行
  sed '1d' xxx.DE_results
  sed '1,10d' xxx.DE_results # 删除前十行
• AWK搞定筛选
  • |log2FC| > 1
    awk中无绝对值写法，可以用 awk 'sqrt($5*$5) > 1' 实现
  • padj < 0.05
    awk 'sqrt($5*$5) > 1 && $9<0.05 {print $1 "\t" $5 "\t" $9}'
• sort排序
  sort -k 2 # 按照第二列排序，按照字母顺序
  sort -k 2n # 按照第二列排序，按数字大小排序

之后建议做的是富集分析

题外话

• Pvalue矫正有FDR和qvalue方法，矫正结果记为FDR或qvalue或padj；矫正后的pvalue一般会比原来的大
• 成组的配对样品，只能用R语言做，比较复杂
• R语言处理数据可以用dplyr和data.table软件包提高大数据处理速度(结构化数据处理)
• Perl语言文本处理最强大，即非结构化数据。正则表达式perl语言中最常用