illumina测序原理

名词解释

flowcell （流动池）

flwocell是带有流通槽的玻璃滑块，是测序反应的载体，里面有8条lane。

lane（流通槽）

lane是测序反应的平行泳道，是试剂添加、洗脱等过程的发生位置。

tile

每一个lane里最小的单位叫做一个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）。

reads

测序的结果就叫做一个reads，对双端测序来说，5'端reads叫reads1，3'端reads叫reads2。

flowcell

illumina测序的工作流程

https://www.bilibili.com/video/av13107081

一.sample prep（样本准备）

样品准备就是在DNA fragments（片段）的末端添加adaptors（接头）。超声波将DNA分子打断成300-800bp长序列片段（人类基因组打成300-500bp），用酶补平为平末端，然后3‘端加一个A碱基（因为接头的3‘端有一个突出的T），再在两端加上互补配对的adapter，再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库。

adaptor修饰

二.cluster generation(簇形成)

每一个lane固定了两种不同的oligos（寡聚核苷酸引物）（垂直于lane），测序时，两种oligos中的一种和fragment上的adaptor互补结合，如下图所示：

互补过程

再之后双链分子变性，原始模板（左）被洗去，右边链通过bridge PCR进行扩增。随后不断扩增，生成数百万个cluster，如下图：

cluster
之后所有的reverse strands（反向链）被切断洗去，只留下forward strands（正向链）。正向链的3'端会封锁，防止特异性结合。

三.sequencing（测序）

测序从第一个测序引物primer的延伸开始，生成第一个read（读段）。每一个核苷酸都带有荧光标记。四种核苷酸带有四个不同的荧光标记，发射出特征性的荧光信号，这个专有过程叫sequencing-by-synthesis.循环结束后，生成的read product被冲掉，在生成下一个read。整个过程生成数百万个reads，代表所有的fragment。
https://www.bilibili.com/video/av9273946
这个视频的21分有讲双端测序的过程，自己写的过程里没提到第二条链怎么生成的。

四.data analysis（数据分析）

fastq格式

测序后生成的文件为fastq格式，每4行为一个read，read第1行：空格左边（从红色的1开始）为ID信息，DJG8....为测序仪信息，后边数字代表是测序仪运行的第272次。空格右边为barcode信息，用于区分样品。第2行为测序结果序列信息。第4行为碱基质量值。