目前，关于COVID-19患者过度炎症反应的细胞机制仍然是未知，另外，尽管树突状细胞在抗病毒防御中发挥核心作用，但它们对重度的COVID-19发病机制的贡献尚不清楚。巴黎大学的研究人员利用单细胞转录组测序技术，收集中度和重度新冠患者的血液样本，对血液中抗原提呈细胞建立高分辨率图谱，为解释患者病程加重并且为修复免疫缺陷提供新的策略。相关成果于2021年5月发表于Nature Cell Biology杂志（IF：28.824）。
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重症COVID-19患者血液抗原提呈细胞的单细胞RNA测序揭示了抗病毒免疫的多过程缺陷
Single-cell RNAsequencing of blood antigen-presenting cells in severe COVID-19 revealsmulti-process defects in antiviral immunity
发表杂志：Nature Cell Biology（IF：28.824）；
发表时间：2021年5月；
应用技术：10x Genomics单细胞转录组测序；
研究背景
识别潜在的细胞和分子机制对于理解COVID-19的生理病理和指导适当治疗的发展至关重要，先前的研究已经描述了全身炎症反应，提示了新的治疗靶点，然而，过度炎症反应的细胞机制仍然是未知的，另外，其他抗病毒机制及其细胞来源仍有待研究。尽管之前研究表明树突状细胞（DC）在抗病毒防御中发挥核心作用，但它们对重度COVID-19发病机制的贡献尚不清楚。在研究中，对COVID-19患者新鲜外周血中的所有抗原递呈细胞（APC）亚群进行单细胞转录组测序（scRNAseq）。预富集分析将以前外周血单个核细胞（PBMC） scRNAseq研究中未捕捉到的罕见DC亚群进行了表征。本研究揭示了之前未被识别的重症COVID-19患者的多进程缺陷。
主要结果
1. COVID-19患者抗原提呈细胞亚群分布
为了表征循环性抗原提呈细胞（APC）的分子特征，本研究收集15名中度和重度患者进入病房后第1天和第4天的血液，以及4名健康者的血液，并进行10x Genomics单细胞转录组测序。对每个APC子集进行注释，建立了两组健康人群（HC）和COVID-19患者（COVID-19）的APC综合图谱（图1b,c）。同时根据疾病的严重程度进行分类揭示了APC分布的异质性（图1c）。依据严重程度对UMAP嵌入进行拆分同样印证了上述结果（图1d）。
图1 COVID-19患者APC细胞亚群的多样性
2. 炎症相关通路是COVID-19患者的重要标志
研究者对不同组的APC进行基因表达和通路富集分析，共揭示了三组间368个不同表达的基因（DEGs）。与其他组相比，101个基因在健康组上调，中度和重度患者中分别有109个和134个基因表达上调（图2a）。进一步分析结果表明，与中度患者相比，重度组APC其抗原呈递和抗病毒能力降低（图2e）。
图2 COVID-19组APC中炎症相关通路增加
3. COVID-19患者APC中IFN应答受限
与健康人群组相比，COVID-19组的APC中L1B、CXCL2、CXCL8和CCL3显著增加，而IL-18显著减少；TGFB1和IL10RA表达在重度组中降低，但在中度患者组没有降低（图3a）。随后研究者探索炎性细胞因子信号传导（主要是IL1B、IL6 和TNF-α）相关的下游信号通路。与健康人群组相比，中度和重度患者组APC 都显示出更高的标志性炎症通路水平（图3b）。IFN 细胞因子家族是对先天性和适应性抗病毒反应最重要的细胞因子之一，结果显示重度组APC表达较低水平的IFN分子，表明IFN信号传导存在潜在缺陷（图3c）。这些结果表明重度COVID-19 患者组APC 中 IFN 下游功能整体受阻。
图3 重度COVID-19组中与促炎细胞因子相关的下游通路的激活与APC中IFN反应缺陷有关
4. 在重度COVID-19患者中pDCs效应功能存在多程缺陷
在全面解析COVID-19患者APC后，本研究试图解析特定APC子集的变化。为了分析pDC亚群的改变，研究者分离、分簇pDC并比较三组之间的差异表达（图4a）。进一步探讨细胞凋亡和促炎信号特征是否与 pDC固有免疫感应受体的变化有关，利用Nebulosa估算表达值以恢复丢失的特征，并在UMAP嵌入中划分密度估值（图4c）。发现在重症COVID-19 患者pDC中TLR9密度值为零，并伴随 DHX36、IFNAR1 和IFNAR2密度水平的降低（图4c）。为了探索这些调节是否会影响 pDC 功能，研究者定义了四个原始功能模块：“免疫细胞吸引力”（以下简称“吸引力”）、“先天感知”、“抗病毒效应分子”和“细胞毒性”（图4d）。在“吸引力”模块中没有检测到组之间的明显差异。相反，在三组中检测到“先天感应”、“抗病毒效应分子”和“细胞毒性”中的基因，且具有相同的规律：以健康组为基线，在中度组增加；在重度组减少（图4d,e）。
图4 重度COVID-19患者中pDCs效应功能存在多过程缺陷
5. 单核细胞亚群的协同转录改变
既往报道单核细胞与脓毒症和COVID-19的病理发生密切相关。本研究通过独立成分分析 (ICA) 进行降维分析，并根据严重程度标记细胞群。研究发现IC1能区分重度、中度和健康组的CD14+单核细胞，而IC2能区分健康组与 COVID-19组CD14+单核细胞（图5a）。对IC1或IC2的前50个基因分析，揭示了不同组中CD14+单核细胞亚群转录的异质性（图5b）。IC1和IC2前50个基因的通路富集分析，确定了区别健康组和COVID-19组CD14+单核细胞的关键通路（图5c）。“补体”、“TNF-α”、“KRAS”和“缺氧”信号通路在 COVID-19 组单核细胞中上调，而“IFN-α”和“IFN-γ”反应信号通路在重度组降低（图5c）。为了评估抗病毒效应功能，研究者在患者组中运用人工基因功能模块，结果发现与健康或中度组COVID-19患者相比，重度组所有抗病毒效应分子均减少（图5d）。同时，研究者对CD16+单核细胞进行亚聚类，并利用UMAP投影减少数据维度以凸显不同组的聚类特征（图5e）。此细胞亚群在三组间的差异表达与CD14+单核细胞的差异表达趋势相似（图5b,f）。这些结果表明CD16+与CD14+单核细胞在疾病发生发展中存在共同的改变适应机制。
图5 解析所有单核细胞（CD14+和 CD16+）亚群的炎症和抗病毒反应通路
6. CLEC9A+DC和AS-DC独有的转录变化
研究者进一步分析稀有细胞群CLEC9a+DC和AS-DC。与中度和健康组相比，重度组显著上调SEPT7和AREG基因；HLA-DQA2基因和抗病毒IFI27基因则显著下调（图6a）。在中度组AS-DCs中，参与ISG转录的基因（如IRF1，IRF9和STAT2）活性较高（图6b）。重度组COVID-19患者的AS-DC中，RELA、NFKB1、STAT5和STAT3的TF活性增加，表明NFKB/STAT信号传导通路被高度激活。CLEC9a+DC 亚群的 DEG分析显示不同组明显的转录异质性（图6c）。值得注意的是，与健康组相比，中度和重度组IFNGR1 CLEC9a+DC 子集明显减少（图6d），暗示抗病毒应答有缺陷。
图6 罕见的CLEC9A+和AS-DC亚群的分子和功能分析
7. CD1C+DCs中MHC-II和CIITA活性
本研究关注疾病诱导的CD1c+DCs 的改变，首先比较MHC-II 相关基因的基因表达水平，发现重度组HLA-II 基因的整体减少（图7a）。将这些 MHC-II基因的表达值分组，构建一个名为“HLAII”的模块，并基于“AddModuleScore”Seurat对CD1c+DC 进行评分。与健康组相比，'HLAII' 特征在重度组显著降低（图7b）。这与重度组上游 MHC-II 调节因子的表达降低有关。在重度组中参与MHC-II基因合成的转录因子活性降低，而参与髓系细胞命运分化的C/EBP家族成员转录因子活性增加（图7c）。此外，重度组 COVID-19 患者的RELA（NFKB超家族）和AP-1家族的转录因子活性更高，参与调节多种细胞过程，如存活、死亡和增殖等（图7c）。为进一步探究从健康到中度和重度状态过程中 DC发生的转录变化，研究者利用 Monocle3 进行了伪时间分析（图7d）。伪时间树显示从健康到中度的连续变化轨迹，以及向严重组的明显过渡。该轨迹与伪时间值密切相关（图7d，右）。为寻找在其中起作用的多组基因，研究者进行了基于图表的测评。排名最靠前的基因与抗原呈递相关，包括B2M和HLA-DPA1，以及ISG相关的基因（图7e)。MHC-II基因参与 DC-T 细胞相互作用，研究者推测COVID-19 APC 中可能存在DC-T细胞作用缺陷。为此本研究应用ICELLNET算法，推断各组中APC亚群和 CD4+T 细胞之间的潜在相互作用（图8a），结果显示重度组APC-T细胞相互作用明显减少，主要体现在CD1c+DC、CLEC9a+DC和CD14+单核细胞中（图8a,b)。接着本研究探究导致APC-T相互作用减少的分子，发现免疫检查点分子和细胞因子起重要作用（图8b），特别是JAG-NOTCH、CD80-CD28和CD48-CD2相互作用的减少（图8c）。细胞因子IL10-、CCL5-TGFb- 介导的相互作用在重度组受到明显的抑制，这也提示过度的Th1反应所导致的免疫病理（图8c）。
图7 重组COVID-19 CD1c+DC 中MHC-II 和上游转录调节因子下调
图8 重度组 DC-T 细胞相互作用受扰
研究结论
本研究收集了15名中度和重度患者进入病房后第1天和第4天的的血液和4名健康者的血液，通过单细胞测序对血液中抗原提呈细胞建立高分辨率图谱，包括单核细胞和少有的树突状细胞。研究发现重症患者的抗原提呈细胞的抗病毒免疫防御存在多种缺陷：（1）浆细胞样DC（pDC）中促凋亡途径增加。（2）浆细胞样DC中固有免疫受体TLR9和DHX36，以及CLEC9a+DC细胞亚型减少。（3）单核细胞亚群中抗病毒干扰素刺激基因的下调。（4）cDC1c+DCs中主要组织相容性复合体 (MHC)II类相关基因和MHC II类反式激活因子活性的降低，表明病毒的抗原提呈受到抑制。这些机制可以解释患者病程加重并且为修复免疫缺陷提供新的策略。
参考文献
SaichiM, Ladjemi MZ, Korniotis S, et al. Single-cell RNA sequencing of bloodantigen-presenting cells in severe COVID-19 reveals multi-process defects inantiviral immunity. Nat Cell Biol.2021; 23(5): 538-551.
李超 | 文案
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