原文来自：Dickson R P, Erb-Downward J R, Huffnagle G B. The role of the bacterial microbiome in lung disease[J]. Expert Review of Respiratory Medicine, 2013, 7(3):245.
新的不依赖于培养的技术最近已经证明，在健康中，被认为是无菌的下呼吸道，含有多种微生物群落：肺微生物群。越来越多的文献表明，在健康和各种呼吸道疾病中都存在着一种独特的下呼吸道微生物，尽管这些发现的生物学和临床意义仍未确定。本文综述了已发表的健康和疾病患者肺微生物区系、微生物多样性和疾病构成的研究报告，并展望了肺外微生物群的假说和未来研究方向。
简介
虽然肺部在历史上被认为是健康无菌的，最初被排除在人类微生物组项目(HMP)的优先器官系统清单之外，但随后的研究表明，下呼吸道充满了健康和疾病状态下的各种细菌群落。尽管肺外微生物群的研究起步较晚，但其研究领域正在迅速发展，并就肺微生物群与呼吸道疾病之间的关系发表了挑衅性的观察结果(图1)。对肺部微生物群的研究可能会为肺部感染的发病机制提供新的见解和途径，肺部感染一直是世界范围内疾病负担的主要原因[1]，以及以前认为仅与微生物发病机制有间接关系的各种肺部疾病的发病机制。
在过去的十年中，新的不依赖于培养的微生物鉴定技术已经在我们对人体内和体内微生物细胞的丰富和多样性的理解上得到了扩展，这些细胞统称为微生物群。一个人拥有超过一万亿个细菌细胞，而一个人的微生物群中的基因数量是他/她的100[2]倍。常驻细菌在营养吸收、维生素合成、异物代谢、免疫调节、微生物紊乱等方面起着重要的作用，与感染、自身免疫、肥胖、心血管疾病和恶性肿瘤有关[3]。2008，国家卫生研究所认识到微生物组群在人类健康中的重要性，启动了HMP，以确定人体和人体内细菌群落的特征，并探讨其对健康和疾病的影响。本文将讨论我们目前对以下几个方面的认识：(一)分析微生物群的方法，(二)健康肺的微生物群，(三)特定情况下的病肺微生物群，(四)疾病状态下观察到的肺微生物群的一般主题，以及(五)肺外微生物体研究的经验教训、启示和假设。
I.肺微生物群分析方法
现代分子微生物检测技术的研究从未证实过健康个体下呼吸道的无菌性。传统的观点认为健康的肺是无菌的，这是从130年的定义，即从组织样本上细菌在培养基上生长的能力。在肺炎等传染病状态中，细菌病原体或辅助因素甚至难以找到，在这些疾病中，75%的确诊病人没有发现病原体。考虑到人体内70%的细菌不能用标准的医学微生物学培养基[5]培养，这些临床观察仅说明我们对健康和疾病期间肺部宿主微生物相互作用的理解不足。
许多现代细菌鉴定分子技术利用16 SrRNA基因的变异，这是细菌基因组中一个小而高度保守的位点，允许进行基因和物种水平的鉴定。高通量测序16S rRNA基因扩增产生的细菌生物样品产生大量的短序列，随后可以对和排序根据预定义的水平的同源性。然后根据公开可得的分类数据库[6，7]对这些数据进行分类。利用这些原则，454焦测序和illumina测序等平台能够同时识别和量化多个组织样本中的整个微生物群落[8]。(图2)这些敏感和快速的技术，往往比传统的文化相关方法更彻底和准确，在过去十年中，效率大大提高，成本降低。
目前，大多数肺微生物学研究都集中在肺内细菌群落的构成上，类似的技术可以用来描述病毒和真菌生物。病毒和真菌在急慢性呼吸道疾病的发病机制中都可能具有相当重要的作用，但迄今为止关于这一课题的文献还很有限，超出了本文的研究范围。靶向PCR技术已广泛应用于呼吸道病毒和肺孢子虫的临床诊断。
到目前为止，大多数肺微生物分析都是在支气管肺泡灌洗(BAL)液上进行的，或者在囊性纤维化的情况下，是在自发性痰中进行的。上气道微生物群对痰或BAL标本中微生物含量的准确贡献是一个有争议的问题。通过无菌外科外植体获得的肺组织的分析研究已经完成，所有的研究都表明下呼吸道包含一个不同于但与上气道相关的微生物群[9-12]。有人提出了一种上呼吸道微生物(经支气管镜污染或围术期微抽吸)的方法，即通过对上呼吸道标本[13，14]信号的去除，但这种方法既未得到验证，也未得到普遍采用。一些研究人员建议采用中立生物多样性理论[15，16]，以评估下呼吸道中检测到的微生物是否是上呼吸道微生物群的直接延伸(在这种情况下，其相对浓度应反映上气道微生物群)，或下呼吸道因素中的选择性压力是否有利于特定物种的相对丰度[17]。在这一概念框架内，“无效假设”是，没有独特的选择压力作用于细菌繁殖在下呼吸道，在这种情况下，细菌在BAL标本中的相对浓度应该与上呼吸道的细菌的浓度相当。BAL中大量存在的物种的存在将否定零假设(并且不符合“中性模型”)，这意味着在下气道细菌物种有一个独特的生态位。
在这些问题得到解决之前，不可能准确地比较下呼吸道和身体其他部分之间的细菌生物量，但肺泡和小气道中细菌的浓度可能大大低于口或下消化道的细菌浓度，最多可与胃或小肠的细菌浓度相比[18]。这些低绝对水平的细菌生物量给该领域带来了特殊的挑战，即上呼吸道出现假阳性信号的风险，以及试剂或实验室环境中出现的低水平信号的意外放大。为了解决这一问题，最近的研究不仅包括上呼吸道生物样本，还包括支气管镜冲洗和试剂对照。
上述鉴定细菌的分子技术的一个重要方面通常不会在本质上区分死细菌和活细菌，而只是鉴定分析样本中是否存在dna。这与传统的依赖于文化的技术不同，后者需要有活的有机体。这是这些新技术应被视为对传统微生物鉴定方法的补充，而不是替代方法的一个方面。
II. 健康肺的微生物群
胎儿的肺，就像胎儿的肠子一样，被认为是无菌的，婴儿的肺很可能在出生后获得微生物群落。在分娩后即刻，婴儿粘膜表面迅速被来自母亲的微生物所填充(阴道分娩时的阴道和肠道微生物，Cesaerean切片中的皮肤微生物)[19]。婴儿微生物群最初在不同的体位上是一致的，在随后的几天和几周内被区分为特定地点的群落[20]。健康婴儿肺微生物群的来源尚未研究，但最近对7例囊性纤维化婴儿的纵向研究显示肠道微生物群落与呼吸道微生物群落之间的一致性，证明胃肠道的时间优先[21]。
许多已发表的研究表明，使用BAL样本[9，13，14，18，22-24]健康成人的肺微生物群。当分析门的相对丰度时，一致观察到的最常见的门是：Bacteroides, Firmicutes 和Proteobacteria。BAL标本中描述的门与同期采集的上呼吸道(口咽、鼻)标本相似，但相对丰度不同(例如，放线杆菌的相对频率)。健康对照组中的优势属为Prevotella, Veillonella, Streptococcus和Pseudomon。主动吸烟似乎改变了上气道的微生物组成[25]；其对肺微生物群的影响尚不清楚。在比较英国和美国的标本[26]时，观察了囊性纤维化患者痰微生物区系的差异，并报道了不同地理来源的人肠道微生物群有很大的地域差异[27]，但生物地理对正常肺微生物群构成的影响还没有描述。
描述对照病人肺部微生物群的研究由于样本量小和缺乏纵向研究而受到限制；截至2012年底，发表的研究中的对照对象总数为75人[9、13、14、18、22-24]，而来自同一对照者的系列标本尚未报告。肺HIV微生物组项目(LHMP)是一个正在进行的、多中心的NIH项目，旨在补充HMP，目的是通过在多个时间点研究许多没有已知肺病理学的患者的肺部微生物群来解决这个问题。
III. 疾病肺的微生物群
a.囊性纤维化-自20世纪30年代首次描述以来，囊性纤维化(CF)一直与反复呼吸道感染[28]有关，而这种系统性疾病的发病和死亡的主要原因仍然是进行性气道阻塞和相关呼吸道感染[29，30]。用培养技术检测的常见病原体包括金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌和随年龄增长的铜绿假单胞菌。间歇性和最初(表面上)可根除的感染之后是培养可检测的气道定植，患者容易感染其他罕见的呼吸道病原体，如嗜麦芽窄食单胞菌和盲肠吸虫复合体(Burkholderia Cepacia)。
近十年来，非培养微生物鉴定技术一直被用来表征CF患者的气道微生物群，而CF的肺微生物群的报道比所有其他呼吸道疾病加起来的结果都要全面[10，23，26，31-58]。应用了多种分子技术，包括末端限制性片段长度多态性分析[23，26，31-35，39，44，47，49，57]，克隆文库测序[31，32，36，38，42，45，46]，焦测序[10，42，47，48，50-52，58]，生理芯片[43]和光照[55]技术。大多数研究都是针对自然祛痰样本进行的，很少使用BAL[31，35]和肺组织[10，23，46，48，54，56]。这些引文清单并不全面，并且强调了试图描述下气道微生物群落特征的研究。
分子方法揭示了CF气道微生物区系以前未被认识到的复杂性，无论是在活动恶化期间还是在活动恶化之间。罗杰斯等人早期重要的观察发现，活动性细菌性呼吸道感染患者的痰中含有大量的多种细菌[32，33，44]。随后的研究再次证明了气道定植和感染在CF中的多微生物特性，包括许多以前通过培养依赖技术而未被识别的物种。这一发现可能部分解释了长期观察到的痰培养、形态和敏感性结果与患者对抗菌药物治疗的反应之间的不一致[59]。这一观察对急性和慢性使用抗生素治疗的临床意义尚不清楚，但它表明，与其“清除”感染，相反，使用抗生素改变了动态和异质微生物群落的内部结构。一项单一的研究发现非CF型支气管扩张症患者肺部的复杂性相当[54]，但尚未确定这些发现是否普遍适用于其他形式的肺部感染。
对CF肺微生物群的研究已经发现了许多以前未被承认的细菌，这些细菌在CF恶化、炎症和气道破坏中具有潜在的致病性。对厌氧物种[32-34]产生了特别的兴趣，其共同的存在和生存能力随后通过培养依赖技术得到证实[60]。目前还没有发表的临床试验，无论是前瞻性的还是其他的，研究了针对这些微生物的靶向抗生素治疗是否有益，其临床意义尚未确定。
有几项研究已经研究了肺微生物群的多样性是否随病情的时间或严重程度而变化。Cox等人采用纵向分析的方法证明，随着气道阻塞的年龄和严重程度，细菌群落多样性降低；同一研究发现，纯合子ΔF 508突变的患者与异种-ΔF 508患者和非ΔF 508患者相比，微生物多样性降低[40]。Klepac-Ceraj等人还发现，随着年龄的增长，微生物多样性逐渐减少，并证实了全身和吸入抗生素对多样性的负面影响[43]。在迄今公布的最大和最长期的CF气道样本中，赵等人显示，随着时间的推移，多样性逐渐减少，但在轻度气道疾病患者中相对稳定[58]。在这个系列中，最近抗生素的使用是微生物多样性下降的最有力的预测因子。Stressmann et也观察了抗生素治疗对肺微生物学的直接影响。他观察到抗生素前的群落结构似乎在抗生素暴露后一个月内恢复到显著水平[57]。
最近，一项研究比较了对重症晚期CF患者的移植肺组织、咽喉和痰标本进行的独立培养分析，发现痰祛痰准确地代表了相对均一的下呼吸道中的优势微生物，但夸大了非典型细菌种类的多样性和代表性[10]。大多数下呼吸道样本绝大多数由一至三种典型呼吸道病原体组成。作者提出了“减去”上呼吸道微生物群的方法。
两个临床试验已经检查肠道益生菌是否影响CF患者肺恶化的频率和严重程度[61，62]。这些研究虽然规模较小，但都发现与对照组服用安慰剂[61]相比，肺部恶化的频率显著降低，与益生菌治疗前后的研究对象相比[62]。这些发现必须在更大的试验中验证，然后才能推荐常规的临床使用，但它们对疗效的机制提出了挑衅性的问题。这两项研究的作者都推测，减少肠道壁炎症对肺部炎症的间接影响可能会产生益处，但目前尚不清楚肠内益生菌如何影响肺微生物的组成。
b.哮喘和变态反应气道疾病--儿童感染频率的降低与哮喘和过敏的发展增加之间的联系多年来一直被人们认识到，这就产生了“卫生假说”：早期感染的减少会导致粘膜耐受性紊乱和自身免疫病的增加[63]。多项研究发现，儿童早期抗生素暴露与哮喘和过敏的后续发展之间存在关联[63，64]，推测正常微生物群的破坏可能与这些疾病的发病机制有关。
两项重要的研究已经研究了哮喘患者与健康对照者肺微生物组的组成[18，24]。[18]Hilty等人比较了哮喘患者口腔、鼻腔和BAL标本与慢性阻塞性肺疾病患者和健康对照者的微生物群[18]。在哮喘患者中，作者发现与对照组相比，蛋白质杆菌的频率增加，Bacteroidetes细菌的频率降低。这种相对增加的Proteobacteriae细菌是由Haemophilus, Moraxella和Neisseria 导致的。
随后，Huang等人将65例控制不良的哮喘患者的肺微生物(用保护标本刷获得的支气管微生物)与10名对照组进行了比较，发现哮喘患者的细菌负担和细菌多样性均有所增加[24]。他们证实了哮喘患者中Proteobacteriae细菌相对丰度的增加，并发现多种细菌的存在与支气管高反应性的严重程度呈正相关。当使用克拉霉素时，在支气管高反应性患者中发现了更大的多样性，这是在肺微生物群构成与临床干预的功能反应之间的罕见观察之一。
除了肺部微生物群在气道过敏性疾病中可能发挥的作用外，一个互补的假设是，由于抗生素的使用和西方地区的低纤维、高糖饮食而引起的胃肠微生物群组成的紊乱已经破坏了胃肠道微生物体介导的粘膜耐受机制。支持这一假说的数据包括工业化国家[65-69]哮喘/过敏与抗生素使用之间的相关性，以及粪便微生物群改变与特应性疾病之间的相关性[70-76]。在抗生素治疗和无菌小鼠中对这一假说的直接测试支持了肠道微生物群的变化与肺部过敏反应之间的这种潜在联系[77-79]。一些研究实验了乳酸菌口服给药对实验性过敏性肺部炎症的调节作用。
c.慢性阻塞性肺疾病-自早期现代描述以来，慢性阻塞性肺疾病(COPD)被推测至少是由慢性和反复呼吸道感染引起的炎症引起的[80]。然而，呼吸道破坏与呼吸道定植/感染之间的因果关系方向仍然不确定，尽管已有几十年的积极研究[81，82]。最近的一项试验显示慢性阿奇霉素对慢性阻塞性肺病(COPD)频繁加重的患者有好处，引起了人们对肺/气道微生物区系交叉、炎症和不可逆气道阻塞的重新兴趣[83]。在过去四年中，有七项研究报告了COPD患者的肺微生物群[9，12，18，22，23，39，84]。除一名患者外，所有患者没有呼吸道感染的积极证据和最近没有使用抗生素，用于分析的样本包括BAL[9，12，18，22]，移植的肺组织和痰排痰[39]。这些研究表明，COPD患者的下气道和肺泡中含有明显的微生物群，这可能与疾病的慢性进展和感染性恶化的间歇性发展有关。
Hilty等人对哮喘患者微生物群的早期研究包括5例COPD患者[18]。COPD患者标本的微生物区系与哮喘患者相一致，并与健康对照者不同，蛋白质细菌的相对存在量相似地增加，类杆菌的数量也相对减少。值得注意的是，与对照组相比，COPD标本中含有更多的嗜血杆菌，这是COPD加重期最常见的培养生物。
在随后的一项研究中，Erb-down等人比较了在BAL和移植肺组织中发现的严重COPD患者与没有肺病或阻塞性通气功能障碍的吸烟者和非吸烟对照者的肺组织[9]。他们发现，16 SrRNA基因在他们的群体中的浓度是相当的，这就意味着他们的细菌负担是相当的。气道阻塞最严重的受试者微生物多样性明显降低，在属级成员中存在广泛的重叠现象。COPD标本中常见的属为假单胞菌属、链球菌属、Prevotella属和嗜血杆菌属。作者分析了同一肺内多个部位的组织(来自移植受者移植的本地肺)，揭示了严重疾病患者肺内(甚至单个肺叶)内肺微生物的明显区域异质性。
Sze等人还对手术获得的肺组织标本进行了研究。[23]他发现COPD肺组织中细菌细胞数量较少，与对照组相比，差异无显著性。COPD患者和对照组的多样性明显大于分析中的CF患者。与吸烟和非吸烟对照相比，COPD患者中发现了一种明显的微生物群，蛋白质细菌和类杆菌的丰度相当，但与对照组相比，厚壁菌微生物数量增加。乳酸菌属的增加推动了厚壁菌的增加。本研究与其他研究的一个重要区别是，分析的组织大部分可能是肺泡实体，而气道包涵体相对较少，这可能解释了所发现的相对丰度的一些差异。
Cabrera-Rubio等人通过对8例COPD患者痰痰标本、支气管吸入液标本、BAL标本和支气管粘膜活检标本的分析，研究了8例COPD患者的呼吸微生物群[12]。他们观察到与以前的研究(蛋白质细菌、细菌、放线杆菌和第一菌)相同的门，其中链球菌、Prevotella、Moraxella、嗜血杆菌、不动杆菌、镰刀菌和奈瑟菌在这些属中占很大比例。他们发现BAL中的微生物区系与支气管粘膜标本具有一致性，但随着类杆菌和厚壁菌的频率的增加，上呼吸道标本(支气管吸痰和祛痰)的微生物多样性降低。
Pragman等人用焦测序法比较了22例COPD患者和10例对照组BAL的微生物区系，发现COPD患者的微生物多样性增加，且与梗阻程度呈正相关。COPD和对照标本中最常见的门是放线菌、纤支杆菌和蛋白杆菌。这项研究的一个重要贡献是认识到BAL样本的微生物区系不仅与疾病状况有关，而且还与吸入支气管扩张剂和/或吸入皮质类固醇有关。这一观察，结合吸入糖皮质激素与严重肺炎发生率增加有关的临床观察[85]，应有助于进一步研究吸入药物对肺微生物区系的影响。
一项单一的研究探索了COPD患者急性加重期呼吸标本的微生物区系[84]。Huang等人研究了8名因COPD加重而导致呼吸衰竭的机械通气患者。与其他COPD研究的对象不同，这些患者都是在样本采集之前接受了最近的抗生素治疗。尽管如此，在分析的气管内吸气液中发现了令人印象深刻的微生物多样性。机械通气时间对所鉴定的微生物区系构成有影响，作者鉴定了所有标本中有75个细菌类群和27个细菌科的“核心”，包括假单胞菌科、肠杆菌科、弯曲杆菌科和螺旋杆菌科。本研究的一个重要参数是，受试者来自于呼吸道标本中培养的铜绿假单胞菌的大量插管患者。
d.肺移植-肺移植受者的死亡率和移植物功能障碍仍然高于所有其他实体器官移植的死亡率和移植物功能障碍，大多数发病率可归因于感染或毛细支气管炎闭塞症(BO)和毛细支气管炎闭塞综合征(BOS)：小气道慢性纤维增生，导致进行性、不可逆转的气道阻塞。虽然发病机制尚不清楚，但微生物感染/定植与BOS之间存在多种关联[86-88]。肺移植会导致呼吸道宿主防御系统发生许多变化，从而改变肺部的微生物区系，包括气道结构的扭曲、本土淋巴通道的中断以及抗排斥药物的全身免疫抑制。
Charlson等人最近发表了一项研究，将来自23例肺移植受者的BAL标本的微生物群与6名非移植对照组的样本进行了比较[89]。他们发现移植受者的微生物多样性下降，在一些情况下，单一物种(如铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)的存在非常普遍。在这些情况下，通常在常规培养中也能发现优势菌的特征。作者还对移植受者BAL中真菌种类进行了分析，发现有丰富的念珠菌和曲霉菌种。微生物组群组成与临床特征如急性或慢性排斥反应之间的重要联系尚未报道，目前仍不清楚。Borewicz等人随后的一份报告发现，与两个对照组相比，移植受者之间的多样性有所增加，移植门以蛋白质细菌门的Burkholderaceae科为主[90]。这一家族在任何一个对照标本中都没有被发现。在BOS发生前后，作者没有发现微生物群的明显聚集。
e.特发性间质性肺炎-一项单一的研究描述了特发性间质性肺炎患者的微生物群[91]，这是一种慢性弥漫性肺部疾病的异质性类型。用变性梯度凝胶电泳等方法对20例肺间质性疾病(特发性肺纤维化、非特异性间质性肺炎和急性间质性肺炎)患者BAL中的微生物群落进行了分析。两种典型的呼吸道病原体(如流感嗜血杆菌)和各种以前未被识别或未被识别的生物体都已被确认。挑衅性地观察到肺孢子虫的存在与细菌负担之间存在负关联，提示肺孢子虫与细菌之间可能存在体内拮抗作用。
机械通气-除了上述黄等人关于慢性阻塞性肺病加重期的研究[84]外，弗拉纳根等人仅有一份报告描述了机械通气患者呼吸标本的微生物群[92]。在Huang研究中，根据呼吸培养中是否存在机械通气和铜绿假单胞菌的情况，选择了入选患者，限制了所有通气患者的通用性。作者注意到在使用广谱抗生素期间呼吸微生物的多样性明显下降，通常伴随着优势生物的重组(通常是铜绿假单胞菌，尽管同时使用抗假单胞抗生素)。进一步的纵向分析可能有助于揭示抗生素和其他急性干预措施对肺部动态微生物群落的影响。
IV.呼吸系统疾病的一般主题
a.时间和空间的异质性-至今还没有发表的研究描述了健康对照的一系列呼吸道标本的纵向分析，因此“正常”肺微生物体的相对稳定性或动态性质尚不清楚。到目前为止，对肺部微生物标本的纵向分析几乎都是对CF患者的痰标本进行的[40，49，50，52，57，58]，这可能不能准确地反映他们下气道的微生物区系[10]。在发表的纵向研究中，个别病人痰中的微生物群落随着时间的推移相对稳定，尽管出现临床恶化和抗生素的使用[52，58]。由于痰分析的局限性和CF独特的临床特征，从这些观察中推断出任何关于健康和其他呼吸道疾病中微生物群稳定性的结论还为时过早。如上所述，正在进行的LHMP将包括非疾病患者的连续取样，并应提供更多关于肺微生物学的时间稳定性/动态的信息。然而，肺环境连续采样的深度/精度(与连续粪便采集肠道环境的连续采样相比)将始终是一个问题，除非未来的技术进步允许反复对下气道进行无创微生物群分析。
在考虑微生物群落空间变异的两项研究中，严重COPD[9]和重度CF[48]的空间异质性显著。目前还不清楚这一发现是否是特定于这两种疾病的末期，这两种疾病的特征都是局部粘膜间隙受损，或者其他疾病的肺部在空间上是异型的。
对上呼吸道和下呼吸道同时取样的样本进行比较的研究发现，上呼吸道标本中拟杆菌和叶放线菌的相对丰度增加，但微生物群落相似，但有明显区别。这些结果表明，呼吸道并不像传统上讨论的那样，是由离散和独立的间隔组成的。一个更精确的模型是，呼吸道是一个单一但内部异质的生态系统，从鼻翼延伸到肺泡，其中包含一个连续的、不断变化的微生物地形。来自上气道的微生物很可能通过直接的粘膜延伸和睡眠时的微吸入不断地进入下气道，这是普遍存在的，通常是无症状的[93]。来自下气道的微生物通过纤毛运输和咳嗽不断进入上气道，即使在没有呼吸道症状的患者中，这种情况每天也会发生多次[94，95]。呼吸道特定部位微生物群落的组成可能是这些影响以及温度、氧分压、pH、营养密度、局部宿主防御和种内及种间小分子信号等生长条件的综合作用。
b.疾病的多样性和严重程度--微生物多样性与呼吸道疾病的存在和严重程度之间的明确趋势迄今尚未在发表的研究中出现。在慢性阻塞性肺病(COPD)中，据报道肺微生物群的多样性与对照组相比增加[22]、减少[9]和相应的[23]。对肺移植受者BAL样本进行的类似分析发现，[90]增加了和减少了[89]多样性。这些相互矛盾的结果表明，单个受试者肺微生物群的多样性可能是多因素的，不能被解释为其疾病严重程度的一个简单功能。在某些疾病状态中，使用抗生素[43，58，92]，年龄[40，43]和CF基因型[40]影响多样性。进一步的研究，特别是纵向取样，有望发现其他多样性的驱动因素，并揭示其临床意义。
c.新病原体的鉴定--肺部微生物群研究的一个直接和短期目标是应用分子技术，通过培养技术来识别以前不被或过度重视的呼吸道病原体。我们对“病原体”、“污染物”和其他已鉴定的微生物之间的区别有了进一步的了解，这包括：1)新认识健康肺中的常驻细菌；2)在活动性感染状态下，识别与已知病原体同时存在的病原体；3)缺乏机械动物模型；4)缺乏纵向数据或临床试验。根据环境的不同，一个特定的微生物可能与其宿主有着完全不同的关系：在健康的稳态中，宿主与微生物的相互作用可能是互利的或中性的，但当稳态被破坏，微生物超越其生态位并通过毒力因子或通过激活宿主免疫间接造成组织损伤时，则是致病性的。仅是对活动性感染患者肺部微生物DNA的鉴定，仅仅是我们对肺部感染发病机制的认识的第一步。
考虑到这些注意事项，并承认大多数上述回顾性研究排除了有活动性感染的患者，一些研究已经在有临床感染证据的患者的呼吸道标本中确定了大量可能未被识别的呼吸道病原体的浓度。其中大部分是在囊性纤维化文献[35，36]中收集的，其中收集到的大部分痰要么是活动恶化的背景，要么是病人与已知的致病微生物“定居”后收集的痰。新的候选病原体包括利索杆菌、立克次体、利莫苏斯、肺孢子虫和猪链球菌等。特别是厌氧菌，如Prevotella和Veillonella属，其共同存在已通过培养技术[60，96]，已确定这些微生物的浓度相当于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的浓度。如上所述，这些发现必须被理解为可能受到上呼吸道污染的限制[10]，迄今为止还没有发表临床试验来检查治疗这些潜在病原体的有效性。
在少数几项非CF研究中，包括有临床证据表明有活动性感染的患者，非培养技术证实了由基于培养的技术检测的物种占肺微生物群主要成分[92]，但同时存在许多其他具有不确定意义的生物体[84]。鉴于上述关于慢性肺病患者和非慢性肺病患者在未主动感染时肺微生物构成差异的观察，我们对“病原体”定义的理解可能需要修订和扩展。
V. 肺外微生物群研究的经验教训、意义和假设
肺微生物学研究领域对其他器官系统微生物区系的研究具有并行性和类比性的优点，其中许多器官系统在人体、种群和动物模型水平上已经被研究多年。对肺外微生物群的研究结果进行了综述，揭示了肺微生物学研究的潜在方向。
a. 修正简单化和过时的定义---肠道、皮肤和泌尿生殖道微生物群落的调查人员已不再将所有常驻微生物简单地称为共生微生物(从宿主或向其提供益处)或病原体。我们对幽门螺杆菌的理解是一项信息丰富的案例研究：虽然胃曾经被认为是无菌的(如肺)，但在许多受试者中(通过改进的诊断技术)显示胃含有大量的幽门螺杆菌，与消化性溃疡病和胃恶性肿瘤的发展有很强的关联[97]。然而，随后的研究揭示了幽门螺杆菌(Hp)与食管反流[98]和哮喘[99]之间的显著负相关关系，以及根除幽门螺杆菌与肥胖之间的机械联系[100]。这种生物最准确地被认为是一种“两栖动物”，一种与宿主有关系的常驻微生物，视环境而定，可被认为是共生的或致病性的[3]。目前尚不清楚这种“两栖动物”是否属于肺微生物学中描述的物种，以及哪些局部和系统因素可能影响它们与宿主关系的性质。
除了完善我们对个体微生物命名的理解之外，对微生物群的研究还应该促使我们重新审视我们对什么是传统意义上的“感染”、“定植”和“健康”(即传统理解中的下呼吸道无菌)的理解。这些术语显然不足以解释迄今为止肺微生物群的发现。一种更好的理解将主动感染和“健康”肺微生物群的多样性置于一个连续体的两端，在不同程度的“失调”中分离出来，如细菌性阴道病和炎症性肠病。该模型将主动感染(如细菌性肺炎)理解为“正常”肺微生物群复杂的稳态破坏的一种紧急现象，而不是以前无菌室中侵入性有机体的不受抑制的生长。要全面描述肺部感染，就需要了解宿主肺部微生物群的组成及其抗扰动能力，这是科赫的假设[101]传统中缺失的一种元素。
b.“肺型”--近年来，人们一直致力于定义在人类肠道中联合在一起的细菌群落，它们是肠道微生物区系的特征“指纹”：“肠型”。在2011年的一项重要研究中，Arumagam等人描述了三种不同的肠道微生物群，它们的组成不同，地理位置不特定[102]；随后的一项研究表明，肠道肠型可能受饮食的影响[103]。肠型的临床意义尚不确定，Arumagam等人随后的分析表明肠道微生物群在不同的肠道类型中存在较多，而在不同的肠型中则较少[104]。但是，在随后的研究(特别是LHMP)中，一个重要而容易回答的问题是肺微生物群中是否存在类似的“肺型”，以及它们是否有助于进一步“表型”复杂和异质性疾病，如COPD。
c.肺内宿主微生物与微生物相互作用的机制--对人类肠道微生物群和动物模型的研究表明，微生物影响宿主炎症和微生物耐受性、宿主营养和药物代谢的机制以及微生物群落相互沟通和相互影响的方式，发现了许多发现。肠道微生物群与粘膜免疫的界面是动态的双向通讯。宿主免疫介质包括粘液层等物理屏障、上皮细胞分泌抗菌肽和产生微生物特异性IgA的复杂细胞免疫；反之，肠道微生物通过内毒素信号介导淋巴成熟、介导上皮修复、影响Th1/Th2平衡，并能促进本地微生物的粘膜耐受性[105]。大多数这些相互作用都是通过目前描述良好的小鼠肠道微生物群模型得到澄清的；由于在肺微生物学研究领域缺乏类似的模型，因此排除了对肺微生物区系的任何这样的观察。然而，我们已经观察到，小鼠肠道微生物群的紊乱会影响过敏性气道疾病的易感性[106]；这在多大程度上是全身免疫改变的结果，而不是GI和肺微生物群之间更直接的相互作用。
最近的研究还揭示了细菌和宿主通过类似人类激素的小分子进行交流的多种机制，并影响细菌群体感应、宿主上皮细胞基因的表达和微生物毒力因子的激活[107]。长期以来，人们都知道许多微生物分泌抗菌肽；事实上，我们临床上可用的大多数抗生素最初都来自于细菌或真菌生物。这些观察表明，要全面了解肺微生物学体，就需要对微生物与微生物的相互作用进行研究，有可能作为上述“肺型”的中介。
d.微生物群对未发病人群的影响-微生物群紊乱与大肠癌[108109]和类风湿关节炎[110]之间的关系，以及一些可能的致病机制，都被描述为与微生物无典型性相关。到目前为止，还没有发表的研究对原发性肺癌或自身免疫性肺病患者的肺微生物群进行了研究。由于我们才刚刚开始了解疾病状态对微生物群的影响，因此肺微生物群不应被认为与任何疾病状态都无关，尽管它与我们对微生物发病机制的传统认识有着间接的联系。
** e. 微生物学作为治疗目标-如果一个紊乱的肺微生物群被证明参与了疾病的发病过程(而不是偶然和次要的精神错乱)，它将作为一种新的治疗干预靶点而引起人们的关注。肺微生物群，就像其他组分一样，有可能被操纵，目的是通过使用益生菌(为了健康而使用的外部微生物)、前生物制剂(促进特定细菌生长的非吸收分子)、抗生素和群体感应分子抑制剂来纠正失调和恢复“健康”微生物群落。
迄今为止，研究口服益生菌在胃肠道疾病中应用的临床试验在预防抗生素相关性腹泻[111]和治疗急性感染性腹泻[112]方面最为有力；对于难治性抗生素难治性难治性感染患者，肠道微生物群移植已显示出治愈的巨大希望[113]。这些表明，在肺部疾病中，有针对性的微生物群治疗最合适的早期目标可能是那些具有直接感染成分的疾病，如肺炎和支气管扩张症。
事实上，已经发表了几项关于肠内给药益生菌的肺部效应的研究，并取得了有希望的结果[114]。在2010年对146名机械通气患者的研究中，益生菌的使用显著降低了呼吸机相关性肺炎的发展速度(40%比19%)[115]。许多研究已经检查了口服益生菌在预防上呼吸道感染方面的作用，大多数研究(17/21)都有益处[116]。以上讨论的两个小的随机对照试验显示接受益生菌治疗的患者CF恶化的频率降低[61，62]。在这些研究中，是否通过直接改变肺微生物学区或通过肠粘膜介导的全身免疫效应间接传递益处，尚不得而知。
如肠内微生物移植治疗艰难梭菌的案例所示，给药途径在有针对性的微生物群干预中非常重要。吸入或直接在肺内注入益生菌或益生菌可能会对肺微生物菌群产生与肠内给药截然不同的影响。
除了对肺部微生物群落的战略性操作之外，我们还可以借鉴微生物所使用的上述分子中介物的研究经验，以相互沟通，并宿主上皮细胞和炎症细胞。居民微生物可能已经产生了真正的小分子药典，可以影响局部和全身炎症、黏膜耐受性、气道反应性以及微生物的协同和拮抗作用**。
专家评论
现代独立于培养的微生物识别技术已经彻底改变了我们对居住在呼吸道的细菌群落的理解，无论是在健康状态还是在各种疾病状态下。肺微生物群的构成与临床主要结果之间的重要联系已经被观察到，进一步的研究有望阐明肺部感染和慢性肺部疾病的发病机制。这一领域将促使研究人员重新考虑长期以来关于健康和疾病呼吸道中微生物与宿主之间复杂和动态关系的观点。
五年展望
目前肺微生物学的研究还处于起步阶段，目前的研究大多局限于小样本、缺乏纵向样本和对照对象。我们预计，在未来几年，以下发展将使我们对肺微生物学及其在人类疾病中的作用的理解更加成熟：
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