一、分子标记（Molecular marker）
分子标记是继形态学标记，细胞学标记，生化标记之后，更为可靠的遗传标记技术。因为形态，细胞状态，生化反应等，都会受外界生物和非生物因素、个体本身生长阶段等影响，相比之下，分子的存在相对稳定。
我们先来看看分子标记的基础概念。广义的分子标记是指生物（biologicalmolecular markers）或其他对象（Non-biologicalmolecular markers）中的，可反映该个体一定特征的分子。
基因组DNA存在丰富的多样性（polymorphism），反映了生物个体在DNA水平上的差异，它体现了个体的遗传错误，家族谱系，生命进化史等信息。所以一些特定区域的DNA作为基因标记（genetic markers）可用于疾病诊断，系统发育，DNA条形码描绘，植物育种，株系鉴定等研究。
生物分子标记中除了基因标记，还有蛋白质标记（protein markers），可以用于诊断复杂的神经类疾病(Choe et al., 2002)。而非生物分子标记还可用于环境类研究(Fraseret al., 2003)。本文主要介绍应用和开发较多的genetic markers，其他类型的分子标记已列出了相关文献，感兴趣可以阅读了解。
前面构建克隆载体的文章里（【现学现卖】实验-载体）提到载体里要有标记基因，如果是从前面看过来的读者可能要蒙了。基因标记？标记基因？到底是生物本来就有的，还是我们人为引入的？这里不得不承认语言的精准性在科研中的重要作用。
生物领域中有很多概念，常常让学习者混淆。比如标记基因-labelled gene（或selectable markers）和今天的基因标记-genetic marker。前者的“标记”是形容词，常作为基因工程中方便筛选和鉴定而引入的外源基因；后者的“标记”是名词，是我们今天的主题，承载生物特性信息的“标识”（我暂且这么胡乱命名）。
二、分子标记技术
分子标记技术，就是为了了解分子标记而发展的技术。
Restriction Fragment Length polymorphism-RFLP-限制性片段长度多态性（1974）
是基于分子杂交原理发展出来的最早的分子标记技术。
从它的名字可以看出利用的是限制性内切酶识别并切割基因组DNA分子中的特定位点的活性。如果基因突变的个体与种群内其他个体，或者物种之间的酶切位点可能有差异。那么利用酶的切割，会产生不同数量，大小的片段。利用电泳和southern杂交，结合DNA标记探针（随机克隆的低拷贝的基因组或cDNA片段）就可以得到DNA的RFLP图谱。
得到的图谱可以根据之后的不同目的进行操作，下面的技术得到的图谱也是如此，最后举一个简单又美丽的🌰来说明一下技术的具体应用。
Random Amplified polymorphic DNA-RAPD-随机扩增多态性（1990）
是建立在PCR基础上，对未知序列的基因组进行多态性分析的DNA分子标记技术。顾名思义，RAPD图谱建立在随机引物对供试DNA的随机扩增产生的数量和长度上的差异。
Amplified fragment length polymorphism-AFLP-扩增片段长度多态性（1992）
名字包含了“长度”和“扩增”，可知该方法结合了RFLP（限制性酶切位点产生更加特异的不同长度的片段）和RAPD（PCR扩增节省时间和DNA材料）的优点。是一个快速有效的好方法。
其基本原理是用限制性内切酶，完成基因组DNA双酶切，形成分子量大小不等的随机限制性片段（target DNA）。将特定序列的双链adaptor连接在target DNA两端，形成带有接头的特异性片段。由于adaptor序列已知，所以接下来的PCR中，选择与adaptor结合的特异性引物，特异性扩增连接adaptor的target DNA。通过凝胶电泳得到图谱。
Sequenced Characterized Amplified Region-SCAR-特定序列扩增（1993）
这个确切的说应该是个子技术，基于RAPD, SRAP, SSR标记得到的结果，将特异性分子片段从凝胶上回收并进行克隆和测序，继续研究的技术手段。
SCAR标记所用引物具有极好的特异性，所以PCR条件严格，结果可重复性好，应用较为广泛，很多RAPD, RFLP, AFLP和SSR标记都成功转化成了SCAR标记（其实不高深，通过下面的🌰就明白了），结果稳定。
Simple Sequence Repeats marker-SSR marker-简单重复序列标记（1996）
在真核生物基因组中，常常出现多次串联重复的DNA序列，重复单元为2-5bp的叫做简单重复序列（SSR）。这些SSR含量丰富，随机分布，由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成。保守的侧翼序列固定了SSR在染色体的位置，而核心序列重复次数在生物间具有高度多态性。
Single Nucleotide Polymorphism marker-SNP marker-单核苷酸多态性标记（1996）
单核苷酸多态性（SNP）是指，相同或不同物种的个体DNA序列在同一位置上存在单核苷酸差异的现象。比如单个碱基的插入，缺失，转换，颠倒。同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，因此，在分子水平上研究单个核苷酸的检测是很有意义的（前面讲的都是针对一个片段）。检测SNP的方法有直接测序，SNaPshot，Taqman探针，PCR-RFLP，特异位点杂交(ASH)、特异位点引物延伸(ASPE)、单碱基延伸(SBCE)、特异位点切割(ASC)、基因芯片技术、质谱技术等。后来发展的DNA芯片技术与SNP的应用，以及一系列构建的数据库我先挖个坑，立个旗（目前觉得难懂）。
三、简单又美丽的🌰(Di Francesco et al., 2018)
故事是这样的，作者Alex和小光头发现了黑酵母菌Aureobasidium pullulans L1和L8两个菌株对防治桃子的储藏病害有很好的效果。并且又找了40株是黑酵母菌的不同菌株来检测它们的抑菌效果，再一次确认了L1和L8果然显著优秀。
无奈的是，黑酵母菌广泛存在于自然界，而且彼此长得又那么像，如果以后想用L1和L8，或者这类对桃子储藏病害有防治作用的优秀黑酵母，难道每次都要一个一个的在桃子上面做实验嘛？有没有一个方法可以快速找到优秀的潜在的生防菌？
于是就用到了分子标记技术，文章用的是RAPD-SCAR-标记。
首先用试剂盒提取了42株菌的DNA，然后用了4个不同的随机引物A6, A8, A9, A10分别进行了RAPD的实验，获得了42株菌与不同引物随机扩增出来的谱图。最后幸运的通过A9引物得到了一个使L1和L8有特异性扩增的条带（这个实验中的特异性条带是900bp），而其他40个在这个位置都没有。
于是对这两个条带进行胶回收，纯化DNA并且进行PGEM-T easy的克隆（【现学现卖】实验-克隆），测序。
针对测序得到的结果，设计特异性引物。在特异性引物合适的条件下，进行PCR扩增。重新在L1和L8里得到了900bp的特异性条带，而在其他40个菌株里没有900bp的特异性条带。这个结果说明我们找到了在黑酵母菌中抑制储藏病害的分子标记，而我们设计的引物也可以用于类似功能的生防菌的筛选。
这个就是分子标记技术的其中一个应用，应用实在是很广泛，由这个例子，可以推想它在人类遗传病诊断和植物优良性状育种中的重要作用。
补充阅读
Choe, L.H., Dutt,M.J., Relkin, N., and Lee, K.H. (2002) Studies of potential cerebrospinal fluidmolecular markers for Alzheimer's disease. Electrophoresis23: 2247-2251.
Di Francesco, A., Calassanzio,M., Ratti, C., Mari, M., Folchi, A., and Baraldi, E. (2018) Molecularcharacterization of the two postharvest biological control agents Aureobasidiumpullulans L1 and L8. Biological control123: 53-59.
Fraser, M., Yue, Z., and Buzcu,B. (2003) Source apportionment of fine particulate matter in Houston, TX, usingorganic molecular markers. AtmosphericEnvironment 37: 2117-2123.
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