肺炎链球菌（S.pn）是一种革兰氏阳性菌，被认为是病原体诱导的肺炎的最常见原因，同时也引起呼吸道感染、肺实质炎症和肺部感染引起的菌血症。而清肺饮（QFY）是一种我国传统中药配方，因其治疗细菌性肺部感染的出色药理作用而闻名，但其作用的分子机制尚不清楚。
在该研究中，研究人员在S.pn感染的小鼠中评估了清肺饮的体内疗效，使用基于应用4D无标记蛋白质组学分析的方法，系统地比较了清肺饮治疗前后蛋白质表达的变化，揭示了清肺饮预防肺炎的分子机制，为未来开发新的治疗方法以对抗该疾病和减少抗生素滥用奠定了基础。
文章详情
中文题目：通过NLRP3/mTOR途径激活自噬：清肺饮缓解肺炎的潜在机制
英文题目：Activation of Autophagy Through the NLRP3/mTOR Pathway: A Potential Mechanism for Alleviation of Pneumonia by QingFei Yin
发表时间：2022.01
发表期刊：Oxidative Medicine and Cellular Longevity
影响因子：6.5434
实验技术：4D-label free蛋白质组学
DOI：10.3389/fphar.2021.763160.
研究概述
研究使用基于高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）的方法测定QFY的化学成分，然后使用两种模型评估QFY对肺炎的保护药理作用：一种是肺炎链球菌诱导的体内小鼠模型，另一种是体外溶血素（PLY）诱导的小鼠肺泡衍生MH-S细胞系模型。值得注意的是，QFY在体内和体外均具有显著的抗肺炎作用。为了进一步探讨QFY的保护作用，进行了4D无标记蛋白质组学分析、病理学评估和免疫组织化学（IHC）分析，以确定QFY保护中涉及的细胞途径。结果表明，NF-κB/NLRP3和自噬途径可能有助于QFY保护相关的药理作用。简而言之，QFY通过下调上游NLRP3/mTOR信号通路事件触发自噬，从而改善炎症损伤。
QFY缓解肺炎的治疗机制概述。QFY通过下调上游NLRP3/mTOR信号通路事件触发自噬，导致炎症损伤的改善。
研究思路
研究内容
1、QFY制剂的HPLC色谱图
本研究鉴定了QFY的19种主要化合物，这19种成分的总离子流（TIC）值如图所示。对10批QFY配方进行了比较和分析，结果表明，QFY保留了其四种中药成分的主要活性成分，且不同批次的制剂具有良好的重现性。
图1 QFY配方的HPLC色谱图
2、QFY对肺炎链球菌肺炎小鼠模型肺病理和炎性细胞因子的影响
在用s.pn（2.5×108CFU/毫升）感染48小时后，制备小鼠肺组织。通过观察小鼠肺组织的组织学变化来评价QFY在体内的保护作用。小鼠的代表性肺组织学显示广泛的肺炎迹象，观察到肺组织颜色加深，并伴有间质性炎症、血管炎、支气管炎和水肿。肺叶充血、肿胀，并有嗜中性粒细胞浸润的迹象。QFY治疗后，肺组织出血和肿胀减少。表明QFY处理的小鼠预防了S.pn诱导的肺部炎症损伤。接下来测量了BALF的炎症细胞因子水平，以研究肺炎链球菌感染对肺部炎症的影响以及QFY对肺炎链球菌诱导的肺炎的保护作用。TNF-α、IL-1β和IL-1β的炎性细胞因子水平增加，因此，上述数据表明，肺炎链球菌感染诱导肺部炎症被QFY疗法逆转。
图2 QFY预防了感染小鼠的肺炎链球菌诱导的肺部炎症损伤
3、QFY治疗改变S.pn感染小鼠的蛋白表达
为了揭示QFY减轻肺炎链球菌诱导的小鼠肺炎的精确分子机制，使用4D无标记定量蛋白质组学分析来检测QFY处理的肺组织中差异表达的蛋白质。在S.pn组与对照组中鉴定出655个差异蛋白质，其中433个蛋白上调，222个蛋白下调。GO功能注释结果表明，免疫和细胞因子产生的调节、对细菌的反应和防御反应注释到。与S.pn感染组相比，QFY处理组中有345种蛋白质差异表达。正如预期的那样，相对于上述其他过程，这些差异表达的蛋白质在病原体感染期间显著富集。综上所述，这些数据表明QFY显著逆转了S.pn诱导的宿主防御和免疫反应的改变。
图3 组分类和GO功能注释
4、QFY治疗通过NOD样受体和自噬信号通路减轻S.pn诱导的肺炎
为了进一步研究肺炎链球菌感染期间的QFY靶和QFY作用机制，进行了基于KEGG的差异表达蛋白的生物学分析。36和13个差异蛋白分别富含NOD样受体和自噬信号通路。使用蛋白质印迹和免疫组织化学(IHC)，进一步验证代表性差异表达的蛋白质。NLRP3和NF-κB信号通路共同参与细胞因子的释放，从而证实了上述信号通路中其他代表性蛋白的参与。自噬已经成为病原体入侵期间维持宿主体内平衡的重要过程，mTOR依赖性自噬被抑制，正如在S.pn感染后48小时mTOR磷酸化和p62积聚所证明的那样。对上述数据的证实表明，QFY通过下调NLRP3的水平和纠正有缺陷的自噬来减轻S.pn诱导的肺炎。研究人员推测，即使没有直接暴露于完整的肺炎链球菌，QFY也可能在体内发挥类似的保护作用，这促使作者通过研究PLY处理的MH-S细胞作为体外肺炎模型来检验这一假设。
图4 QFY改变NOD样受体和自噬信号通路的表达
图5 对照组、S.pn组和S.pn+QFY组（0.42g/kg）小鼠肺组织中与NLRP3组分、自噬途径相关的关键蛋白表达的验证（A，B）和IHC（C，D）
5、QFY对PLY诱导的MH-S细胞的影响
为了进一步探索QFY保护性减轻S.pn感染是否与NLRP3下调（以及自噬激活）有关，作者研究了PLY处理的MH-S细胞中关键蛋白的表达水平。MH-S细胞用PLY（400 ng/ml）和低剂量（25μg/ml）或高剂量（50μg/ml）和QFY共处理24小时。与体内实验结果一致，PLY诱导NLRP3、ASC和裂解的casp1蛋白水平的增加，同时检测到功能失调的自噬。重要的是，据报道NLRP3和自噬途径通过相互调节联系在一起，这些观察启发作者进一步探索涉及NLRP3和自噬途径的双向调节机制，并确定QFY靶点。
图6 蛋白质印迹检测蛋白表达
6、QFY通过下调上游NLRP3\/mTOR途径激活自噬
越来越多的证据表明，NLRP3表达的上调依赖于NF-κB通路的激活。同时，NLRP3作为mTOR的结合伴侣，参与抑制自噬的NLRP3-mTOR复合物的形成。作者进行了Spearman相关分析来评估NLRP3途径蛋白水平和自噬之间的潜在联系。有趣的是，在自噬和凋亡之间观察到了高度显著的正相关。相反，NLRP3、ASC和caspase-1水平与p-mTOR/mTOR和p62水平显著正相关，与p-mTOR/mTOR和p62水平显著负相关，与LC3BII/I和p-ULK/ULK水平相关。总之，这些发现表明肺炎的发展伴随着自噬的阻断，NLRP3和自噬途径彼此负相关。接下来，MH-S细胞对PLY刺激(400ng/ml)的反应通过从6至48小时进行的时间过程实验进行研究。在感染后6小时，NLRP3和ASC的蛋白表达水平没有显著变化。然而，在持续感染48小时后，NLRP3和ASC的表达比它们各自的基础水平增加了3倍多。QFY治疗显著下调了NLRP3途径成分，也修复了缺陷性自噬。总之，QFY抗肺炎链球菌作用似乎与通过下调涉及NLRP3/mTOR的上游自噬途径事件激活自噬有关。
图7 （A）自噬和NLRP3信号通路的Spearman相关分析。（B）MH-S细胞对PLY刺激（400纳克/毫升）的反应通过刺激后6至48小时进行的时间过程实验进行探索。蛋白质在（C，D）中定量，数据以每组（n=3）的平均值±标准差表示，*p<0.05，**与对照组相比p<0.01。
图8 QFY通过下调上游NLRP3\/mTOR途径激活自噬
研究结论
总之，该结果表明，NLRP3通过结合mTOR抑制自噬，而QFY通过下调NLRP3逆转感染受损的自噬。这项研究为今后研究QFY和其他中草药治疗肺部感染性疾病的确切靶点和机制提供了理论依据。
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