MIQE

3. Research vs DiagnosticApplications

qPCR技术的应用大致可分为研究和诊断两个方面。

研究样本通常来源广泛，低通量和样本类型多。需要处理的主要参数为分析的敏感性和特异性，在此背景下，敏感性和特异性分别指分析可以检测到多少目标样本，以及无模板对照(NTC)是否为可靠阴性对照。

诊断样本，数量有限，高通量，样品类型少。尽管所有适用于研究应用的考虑因素也适用于诊断分析，但临床诊断分析还有一些需要考虑的附加要求。这些要求包括分析灵敏度和特异性方面的信息，在这种情况下指的是当存在靶标时， 检测结果呈阳性的概率和无靶标时呈阴性的概率。此外，实验室内部和实验室之间的准确性和精密度通常由外部QC程序监控。其他临床实验室要求包括生成报告结果的标准、样本是否可进行重复测量、假阳性/假阴性数据分辨的数据，以及使用相同和不同技术的在多个实验室结果的相似性。

4. Sample Acquisition,Handling, and Preparation

待测mRNA样品：样品从何处获得，是否立即处理，未立即处理，它是如何保存，在什么条件下，保存了多久，均要描述清楚。对样本的简要描述也是必不可少的。例如，对肿瘤组织的显微镜活检将显示活检组织肿瘤细胞占的百分比。

核酸提取是第二个关键步骤。提取效率取决于充分的均质化、样品类型(例如，原位组织与慢期培养的细胞)、目标密度、生理状态(例如，健康、癌症或坏死)、遗传复杂性以及处理的生物量数量。因此，有必要提供核酸提取方法的细节，并描述用于测定核酸浓度和评价其质量的方法。这些细节对于从新鲜冷冻的激光微解剖活检样品中提取RNA尤为重要，因为组织制备程序的变化对RNA的产量和质量都有实质性的影响。

5. QC of Nucleic Acids

5.1 RNA样品

提取的RNA的定量是很重要的，因为当比较不同的样品时，建议使用大约相同数量的RNA。然而，有几种常用的定量方法，包括分光光度法(NanoDrop;Thermo Scientific)，微流控分析(Agilent Technologies Bioanalyzer, Bio-Rad Laboratories Experion)，毛细管凝胶电泳(Qiagen s QIAxcel)，或荧光染料检测(Ambion/Applied Biosystems RiboGreen)。这些方法会产生不同的结果，因此尝试用不同的方法来比较数据是不明智的。定量RNA的首选方法是使用结合RNA荧光染料(如RiboGreen)，这最适合检测低浓度。在任何情况下，建议只用一种方法测量所有样本，并报告这一信息。

同样重要的是检测和报告基因组DNA污染的程度，并记录这种污染的可容忍量的临界值。有必要报告RNA样本是否用DNase处理过(包括使用的DNase类型和反应条件)，并报告每个核酸目标在阳性和无逆转录对照的情况下获得的Cqs的比较结果。

记录RNA模板的质量评估也很重要。这一要求不适用的唯一情况是，总RNA的提取量太低，无法进行质量评估。当从单细胞、血浆、其他无细胞体液、一些激光捕获的样本或澄清的组织培养基中提取RNA时，就会出现这种情况。它也适用于提取和RT-qPCR步骤作为一个连续的，单管实验进行的情况。报告的关键信息包括RNA数量、完整性的数据，缺少逆转录或PCR抑制剂。值得注意的是，由于mRNA对环境刺激的自然调节，RNA在体内显著降解。这种RNA降解的来源超出了研究人员的控制；其表现之一是，即使是高质量的RNA样本，也可以表现出个体mRNA的降解差异。

A260/A280比值必须在中性pH的缓冲液中测量，但如果核酸用于定量分析，尤其是当mRNA浓度的微小差异(小于10倍)时，这样的测量是不可以的。吸光度比确实能反映RNA的纯度，因为DNA或残余苯酚的存在会改变吸光度比。相反，至少应该提供凝胶电泳证据，或者更好的是，来自基于微流体的rRNA分析或内参基因/靶基因3':5'完整性分析的结果。使用Bioanalyzer/Experion系统计算RNA完整性参数或RNA质量指标的优势在于，这些措施提供了关于RNA样本一般状态的定量信息。然而，重要的是，这些数字与rRNA质量有关，不能期望成为质量的绝对衡量标准。显然，需要进一步的工作来产生一个普遍适用的、经济有效的、简单的方案来评估RNA完整性。

反转录活性或PCR的抑制应通过稀释样品(最好)或使用通用抑制试验，如SPUD来检查。如果RNA样本显示部分降解，报告这一信息是必要的，因为检测低水平转录本的灵敏度可能会降低，转录本降解的相对差异可能会产生不正确的靶标比。

5.2 DNA样品

一般来说，DNA的降解问题要小得多；但是，重要的是能够评估法医应用的DNA降解程度，即在犯罪现场或大规模灾难现场或涉及失踪人员案件的现场的恶劣环境条件可能导致DNA化学结构的降解。qPCR分析的小扩增子大小有助于最小化分析相关问题，但已经开发出了可以提供DNA质量定量测量的方法，专门用于此类实验目的。

潜在的抑制是一个更为普遍存在的变量，必须在出版物中解决，重要的是要确保在DNA纯化过程中没有抑制剂会影响结果，例如，病原体检测和它们的定量。例如带有阳性对照的取样可以用来检测抑制，但不同的PCR反应可能不是同等受到核酸提取物中的抑制。因此，最好是常规使用稀释的核酸来证明观察到的Cqs或拷贝数下降与预期结果一致，并报告这些数据。

6. Reverse Transcription

反转录步骤在RT-qPCR检测中引入了大量的变异。因此，提供将RNA转化为cDNA的程序和试剂的详细描述是必要的。该文件必须包括逆转录RNA的总量、启动策略、酶类型、体积、温度和逆转录步骤的持续时间。建议逆转录步骤重复或三次进行，并且每个样本的总RNA浓度相同。