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1.实验流程
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1.为什么要进行末端修复，产生平齐末端并要3'端腺苷酸化：目前很多PCR使用的高保真Pfu聚合酶产生的片段末端是平齐的（也即没有不配对的碱基）；鸟枪法产生的片段则是随机断裂，其末端可能是平齐的也可能是不平的。因此，建库第一步是使用Taq聚合酶补齐不平的末端，并在两个末端添加突出的碱基A，从而产生粘性末端（若使用Taq酶扩增，则无需末端修饰），产生粘性末端的片段可以添加接头（Adaptor）。
2.3'端腺苷酸化的作用：经过末端修饰后的cDNA片段末端具有突出的A尾，而接头具有突出的T尾，可以使用连接酶将BEBNext接头添加到DNA片段两端。
3.为什么要添加BEBNext接头：文库构建即为测序片段添加不同的接头，一般叫P5和P7。无论是PCR产生的片段还是基因组鸟枪法打断的片段都具有特异性（PCR中不同样品反向引物插入了特异性的barcode，因此两端也是特异的），两端缺乏必要的引物因此混合DNA片段不能直接扩增和测序。DNA片段需要加接头修饰才能进行上机测序，如果我们随机在两端加p5或p7，就会有一半的片段两端加的是相同的接头，这种文库是无效的，原因：在测序芯片flow cell上两端一样的文库走不通正常的测序流程，提前作废了，另外，一般的建库PCR过程中，两端一样片段的变性后两端会aneal在一起，引物竞争不上去，本身也扩增不出来。这个问题会导致从一开始就有50%的文库无效，如果能规避一定要规避。DNA本身 就有头尾5“ 3“方向性，连接时Y接头可以让头尾分别只加一种接头。绿色和黄色分别对应P5或P7，只有模板文库片的5端会接绿色，3端接黄色，不会反接，也不会两端接一样的。另外还有一个附带的好处是，这种库是有“方向性”的文库，也就是read1 和read2只会分别读到原有DNA片段的头/尾信息，而不会混淆。这一步添加的接头主要是为了后续PCR中作为引物扩增继续添加文库index（barcode）和与测序平台互补的寡核苷酸序列（P5和P7）
4.使用USER酶删除碱基U：NEB的接头为特殊的碱基U连接的环状结构（可以增强稳定性），因此连接接头后，还需要将碱基U删除从而形成“Y”形接头，而之所以为“Y”型开叉结构，是因为每一端接头是两条不互补的序列，因为连接酶没有选择性，每个接头都是只靠突出的T来与DNA连接，“Y”接头保证了每条单序列两端均为不同的测序引物，从而在后续PCR中可以连接不同的寡核苷酸序列（P5/P7）USER酶在尿嘧啶位置产生一个单核苷酸缺口。USER酶是尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）和DNA糖基化酶-裂解酶Endo VIII的混合物。UDG催化尿嘧啶碱基的切割，形成一个脱碱基（脱嘧啶）位点，但保持磷酸二酯骨架结构完整。Endo VIII的裂解酶活力使脱碱基位点3′和5′端的磷酸二酯键断裂，释放无碱基的脱氧核糖。，
4.P5和P7作用：P5、P7接头位于文库两端，可以与flowcell上的寡核苷酸结合，在簇生成和测序过程中可作为引物或起到固定模板链的作用。
5.index1和index2是不同的，与p5相连的是index2,与p7相连的是index1,因为一个lane可以同时测多个样品（一台测序仪同时运行多个样本，提高性价比），为了避免混淆样品的read product,每种样品的DNA由一种index修饰，这样测序得到的read都是具有index修饰的（测序仪识别，相当于身份证），在测序结果过，依据index与样品的对应关系，可以获得对应样品的数据
2.数据处理流程
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3.数据来源
本次教程采用文献RNA-Seq Transcriptome Profiling Identifies CRISPLD2 as a Glucocorticoid Responsive Gene that Modulates Cytokine Function in Airway Smooth Muscle Cells，使用数据为GSE52778。
研究背景：哮喘（ASM）是一种 慢性炎症呼吸道疾病，目前，全球大约有3亿人在承受着该疾病的折磨。Glucocorticoids 即糖皮质激素(下文简称GCs)，目前被广泛用来治疗各种炎症性疾病，其中包括哮喘。可吸入型的GCs可直接作用于肺部细胞，GCs主要用于缓解哮喘疾病的症状，并防止哮喘加重。GCs是通过与其受体结果，形成GRs复合物的方式，调节相关基因的表达，激活机体的消炎反应；另一方面抑制炎症因子的表达，达到消炎的目的。
随后验证一批关于地塞米松药物对细胞转录的影响，吃了药物之后，引起哪些基因的差异表达，这些差异表达基因参与哪些代谢，通过这个案例，可以了解药物对代谢的影响。
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四个白人男性的气管平滑肌细胞，8个数据
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