一、实验应用场景

  目前流式细胞术广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达特征的分析，界定不同种类的细胞群，测定分离出的亚类纯度，分析细胞的大小和总量，它可以同时分析单个细胞的多个参数。它主要用于检测标记在抗体上的荧光强度，这些荧光抗体则可以检测与其有特异性结合的分子，如T细胞表面TCR受体等。

二、实验原理

   流式细胞仪的原理：是在一组混合的细胞群中，加入针对特定分子的荧光单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，成为荧光抗体标记的靶细胞，当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。
   在流式细胞仪分离装置中，不同的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的物理（颗粒度，密度，荧光强度）信息，从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。

图1 实验原理示意图

三、实验步骤

流式使用三大步骤：

• 1.单细胞悬液的制作
• 2.相关分子的染色
• 3.上机分析

第一步：制备单细胞悬液

   流式适合检测的样本类型包括外周血、骨髓，灌洗液、体腔积液，培养的细胞系等；如果是脾脏，肝脏等实体器官，则首先得剪碎，消化，制成单细胞悬液再进行下一步实验。

第二步：特异性染色

   将培养的细胞或组织样品制成单细胞悬液，然后将细胞放入流式管或者EP管中与荧光标记或未标记的抗体孵育（根据抗体的不同，分冰上孵育，常温孵育，37°孵育等几种方式，具体看抗体说明）

常见的染色方法有以下两种：

• 直接染色（直标法）：直接染色时，细胞与直接结合有荧光染料（如FITC标记）的抗体孵育。它的优点在于只需要抗体孵育这一个步骤，从而消除了来自二抗的非特异性结合的可能性。

• 间接染色（间标法）：间接染色时，不带荧光的一抗识别靶分子，带荧光的二抗识别一抗，从而达到检测靶分子的目的。另外可选择使用亲和-生物素系统，即抗体与生物素结合并且通过荧光染料标记的亲和素来检测。

  
  图2 两种染色方法示意图

荧光结合染料的选择

   实验室最常见的荧光有 FITC，PE，PE-Cy7，Percp-cy5，APC，APC-cy7等。不同的荧光染料的亮度有强有弱，强弱的相对差异取决于你的仪器，这是因为在不同的仪器上激光和过滤器的组合差异。不同的仪器检测的荧光通道稍有不同，所以染色之前一定要先查好你要用的仪器适合检测的荧光染料。

使用流式该注意的事项：

• 尽可能的制成单细胞悬液，减少细胞黏连。
• 尽可能的让细胞保持活性状态，这样既可以减少非特异性染色，也可以继续进行后续的实验。
• 封闭Fc抗原
• 孵育时间不能多长或过短：过长了，非特异性染色增多，过短了染色不充分，荧光太弱，影响上流式
• 如果要染两种以上的分子，抗体带的荧光不能相同，不然上流式后没办法区分这两种分子
• 选荧光时尽可能的选择互相串色和补偿容易调的两种荧光，比如 FITC 跟APC可以一起用，APC 跟PE 也可以一起用，补偿和电压调起来很舒服
• 注意抗体使用和保存温度：4° OR 37°

流式常见问题及解决方法：

 Q1：无信号/荧光强度弱

可能原因以及解决方法：

• 可能这种分子表达真的很低或者没有
• 可能是抗体不好用，或者荧光跟检测通道不匹配：换抗体
• 没有足够的抗体来检测：增加抗体的量
• 不正确的电压和补偿：调整电压和补偿
• 无法接近细胞内目标：如胞内染色时破膜通透不充分
• 细胞内染色结合荧光分子太大
• 激光器未对齐：机器本身的问题，请联系工程师
• 可溶性或分泌型目标蛋白？目标不同，染色方法不太一样
• 荧光分子的荧光逐渐消退：抗体放置时间太久，荧光已经淬灭
• 一抗和二抗不匹配

Q2：荧光强度过高

可能原因以及解决方法：

• 抗体浓度过高：减少抗体的量
• 过量抗体被困：胞内染色会出现的问题
• 封闭不足
• 电压和补偿调的太高

Q3：背景高或阳性细胞百分比高

可能原因以及解决方法：

• 增益设置过高或补偿过低
• 抗体过量

第三步：上机分析

图3 上机分析示意图
毫不隐晦的说，全篇文章只是略改，全文参见大佬写的文章《关于流式的干货：原理，步骤，注意事项，常见问题及解决方法》