单细胞转录组扩增技术

单细胞转录组测序方法详解

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1 Smart-seq2（扩增全长转录组）

通过ployT抓取，只能检测mRNA。

Smart-seq2步骤:

1 通过ployT抓取，加入SMARTscribe RT逆转录酶合成第1链；（RT逆转录酶可以在合成链后加入C碱基）

2 SMARTer II A引物粘到逆转录出来的第1链上；

3 SMARTscribe RT逆转录酶继续延伸，得到左侧与SMART IIA扩增引物序列互补的延伸序列；

4 加入常规PCR引物，进行常规PCR扩增；

5 打断，建库，测序。

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2 CEL-seq2

1 通过ployT抓取，引物序列包含T7 promoter，Illumina 5' adaptor和Barcode;

2 体外转录

3 RNA打断

4 反转录

5 测序

强烈的3'偏好，高丰度转录本被优先扩增，至少需要400pg总NRA。

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3 Drop-seq

基于使用微流控技术快速分析数千个细胞的策略，将单个细胞封装在微滴中进行分析。

Drop-seq步骤：

1 从组织中制备单细胞悬液；

2 准备条形码引物；

3 使用微流体装置将每个细胞分别与微滴中的明显条形码化的微粒共同封装；

4 裂解细胞，释放mRNA，与引物杂交；

5 打破水滴并产生STAMPs(附着于微粒的单细胞转录组)

6 放大STAMP（常规PCR扩增）；

7 测序分析：通过STAMP的条形码来推断每个转录本的原始细胞。

1 在各个微粒都相似的序列，PCR handle主要用于后续的PCR扩增；

2 bead特异性的barcode，10-12bp,用于区分单个细胞；

3 UMI，Unique Molecular Identifier,4-8bp,用于区分转录本；

4 30bp的oligo-dT,用来捕捉mRNA。