■Q: D-萤光素的作用原理
D-萤光素 (D-Luciferin) 是萤火虫萤光素酶 (Firefly Luciferase) 的化学发光底物。在ATP 和萤光素酶存在下，萤光素能够被氧化发光 (图 1)。当萤光素过量时，发光亮度与萤光素酶浓度呈正相关。通过萤光素/萤光素酶生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因表达、肿瘤生长、药物反应等。
图 1. D-萤光素发光原理
■Q: 游离态和盐形式的 D-萤光素，怎么选？
目前市面上主要有 3 种 D-萤光素，D-萤光素游离酸 (HY-12591A)、钠盐 (HY-12591) 和钾盐 (HY-12591B)。D-萤光素钠盐、钾盐易溶于水，而游离酸形式难溶于水，需要适当的碱中和才能溶于水。配成溶液后，这 3 种形式的 D-萤光素生物活性相当。
■Q: 外生物发光、体内活体成像的检测怎么操作？
以 D-萤光素钾盐为例：
1、体外生物发光检测(In vitro bioluminescent assays)
1) 将细胞铺在 24 孔黑孔板上，铺板密度为 0.5-2.0×105个细胞/孔，37℃，培养过夜。
2) 用超纯水配制 15 mg/mL 的 D-萤光素储存液(100×)。
注：D-萤光素溶液最好现用现配，也可分装后-20℃ 避光冻存，有效期 1 个月。
3) 用预热好的细胞培养基 1: 100 稀释储存液，配制终浓度 150 μg/mL 的 D-萤光素工作液(1×)。
4) 去除培养细胞的培养基直至无残留。
5) 向细胞内添加 1×D-萤光素工作液后，立即进行图像分析。
图 2. MDA-MB-231-Luc2 细胞生物发光检测结果[1](客户验证)
2、小鼠活体成像分析 (In vivo analysis in mice)
1) 用无菌的 DPBS (no Mg2+、Ca2+) 配制 15 mg/mL 的 D-萤光素溶液，0.2 μm 滤膜过滤除菌。
注：D-萤光素溶液最好现用现配，也可分装后 -20℃ 避光冻存，有效期 1 个月。
2)按 150 mg/kg 剂量和 10 μL/g 注射体积向每支小鼠注射相应量的 15 mg/mL D-萤光素溶液。
3) 腹腔或静脉注射 5-15 min 后进行活体成像分析。
图 3. 小鼠活体成像结果[2](客户验证)
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