基础知识3：肿瘤中的三级淋巴结构（TLS）

❀ TLS 的定义与组成

三级淋巴结构 (Tertiary lymphoid structures, TLS)，也称为三级淋巴组织、三级淋巴器官或异位淋巴组织，是在慢性炎症(包括癌症、感染、自身免疫和年龄相关疾病)期间的非淋巴器官中形成异位淋巴结构。TLS与次级淋巴结构(SLO)(特别是淋巴结)具有许多相同的结构和功能特征，主要由B细胞、T细胞、树突状细胞(DC)、中性粒细胞和巨噬细胞组成。TLSs还包括高内皮小静脉 (HEV)和淋巴管，可促进淋巴细胞从血液迁移到淋巴组织。

在肿瘤环境中，TLS 可促进免疫细胞浸入实体瘤，因而 TLS 的发展与未经治疗的患者的生存率显著相关。同样地，在接受免疫检查点抑制剂治疗 (ICB) 的患者中，TLS 的发展通常与改善的治疗反应有关。

1）和之间的结构差异

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ꔷ 包括淋巴结(LN)、脾脏和粘膜相关淋巴组织(MALT)，主要由淋巴细胞组成，并有专门的成纤维细胞支持，并与 HEV 相关，这些细胞亚群以规则的方式分布并形成子区室。
B 细胞形成 B 细胞滤泡，并在抗原刺激期间偶尔发育出生发中心，而大多数 T 细胞驻留在 B 细胞滤泡附近的 T 细胞区域；
基质细胞（本质上是一种成纤维结缔组织细胞，可产生ECM成分并构建三维纤维网络）是构建SLO架构的关键组件，每个区室中的基质细胞亚群产生不同的化学引诱剂，调节表达特定受体的靶免疫细胞的迁移和定位；
HEV是B细胞和T细胞从血液中进入次级淋巴器官的“通道”。大多数HEV排列在血管内部的内皮细胞重叠排列，它们紧密地“粘”在相邻的细胞上，以防止血细胞进入组织

ꔷ TLS 是浸润性免疫细胞的离散、结构化组织，在正常情况下不存在。
TLS 在结构和发育上与淋巴结非常相似，并且 TLS 的组织和完整性由基质细胞支持。
发育良好的 TLS 包含B 细胞滤泡，其具有活跃复制的B 细胞生发中心 (GC)，周围环绕着 T 细胞区域。散布在 TLS 中的是HEV 和树突细胞溶酶体相关膜蛋白 (DC-LAMP) ⁺ 树突细胞 (DC)。
TLS 不被封装，而是发生在各种非淋巴组织中，例如上皮组织和间质。

特征	次级淋巴器官	三级淋巴结构
归纳	在胚胎发育过程中	出生后
位置	发展计划控制下的关键地点	由于损伤、癌症、感染、自身免疫、器官移植或衰老而引起炎症的非淋巴器官或组织的血管周围部位
结构	区室化的 T 细胞和 B 细胞区域	可变（范围从混合 T 细胞和 B 细胞到区室化 T 细胞和 B 细胞区域）
Capsule	Capsule将次级淋巴器官与环境物理隔离	三级淋巴结构没有被封装，直接暴露于组织微环境中的因素，包括细胞因子、抗原、离子和危险相关分子模式
功能	对递送的抗原产生适应性免疫反应	针对局部抗原产生适应性免疫反应

2）TLS 的和
TLS 的细胞组成各不相同，从松散的 T 细胞-B 细胞簇到具有不同 T 细胞区和包含生发中心的 B 细胞区的高度组织结构。TLS 的发展被认为是一个渐进的过程，目前，还很难建立 TLS 状态与疾病进展之间的相关性，定性和定量 TLS 评估方法尚未标准化。

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ꔷ TLS首先出现为血管周围部位（富含细胞外基质成分、小血管、淋巴管和神经元。血管周围区域在器官中是保守的，可以作为组织驻留免疫细胞的生态位），主要含有 T 细胞和 B 细胞的小聚集体，然后扩展并成熟为具有不同 B 细胞和 T 细胞区域的簇；
ꔷ 未成熟的TLS 中，抗原呈递和密切的 T 细胞-B 细胞相互作用驱动淋巴细胞的激活和 TLS 的成熟；
ꔷ TLS 成熟的同时，常驻成纤维细胞转分化为几种不同的表型并协调 TLS 的发育。首先，血管周围成纤维细胞获得产生稳态趋化因子（如：CXCL13和 CCL19）并招募免疫细胞的能力。然后，这些免疫成纤维细胞进一步转分化为滤泡树突状细胞 (FDC) 和滤泡网状细胞 (FRC)，分别形成并支持 B 细胞和 T 细胞区域。一些 B 细胞区域（滤泡）包含生发中心，在组织学上将其定义为增殖的 B 细胞簇。

❀ 肿瘤中三级淋巴结构的结构和形成

由于TLSs没有包膜，其中驻留的免疫细胞直接暴露于炎症微环境的大分子中，因此导致肿瘤内免疫反应的独特性。在许多人类恶性肿瘤中，TLS的存在与患者的积极预后相关，并且与患者对免疫检查点抑制剂治疗有良好响应有关。这表明TLS的存在或许是有利于抗肿瘤免疫应答的。

尽管许多癌症类型中都已鉴定出了 TLS，但缺乏测量 TLS 数量和组成的标准化方法，需基于细胞组成、位置、成熟度和功能等方面的评估对 TLS 进行更全面的表征，以识别一系列不同的 TLS 状态。

1）TLS的
ꔷ TLS有一个被CD3⁺ T细胞包围CD20⁺ B细胞形成的区域，类似于SLOs中的淋巴滤泡，是形成TLS的主体结构。
ꔷ TLS的具体组成可能不同，但通常情况下T细胞群中的主要亚群为CD4⁺ T滤泡辅助细胞(T_FH)，也存在CD8⁺ 细胞毒性T细胞、CD4⁺ T辅助1(T_H1)细胞 和调节T细胞(T_reg)。
ꔷ 在TLS内部还含有不同的树突状细胞群，来自于间充质的CD21⁺ 滤泡树突状细胞(FDC)在SLOs生发中心记忆B细胞的选择中起着关键作用。CD83⁺ 成熟DC主要定位于T细胞区，在一些研究中也被称为树突状细胞溶酶体相关膜蛋白(DC-LAMP⁺ )DC。
ꔷ 滤泡包含一些分散的CD68⁺ 巨噬细胞，用于清除凋亡细胞，与其在SLOs中的作用相似。
ꔷ 除了以上的细胞成分，还有大量基质细胞发挥类似与SLO中滤泡网状细胞（FRC）的作用，将TLS锚定在慢性炎症部位。
ꔷ 外周淋巴结地址素 (PNAd) 阳性的HEV为TLS提供了特殊的脉管系统，介导淋巴细胞募集

TLS-3

2）TLS的
ꔷ 关于 TLS 的上游启动机制，目前尚不清楚是否需要真正的淋巴组织诱导细胞（Lymphoid tissue inducer, LTi）来启动局部间充质积累，或者局部聚集的免疫细胞是否可以替代 LTi 细胞。一种假设：淋巴细胞或基质细胞局部产生趋化因子CXC-趋化因子配体 13 (CXCL13) 和细胞因子白介素 7 (IL-7)，将淋巴组织诱导剂 (LTi) 细胞募集到炎症部位。
ꔷ T辅助细胞17(T_H17)细胞、B细胞或M1极化巨噬细胞在各种病理情况下替代LTi细胞启动TLS发生。这些LTi 细胞与局部基质细胞相互作用，与 SLO 中的淋巴组织组织细胞相互作用，特别是通过淋巴毒素-α₁β₂（ LTα₁β₂ ） 与 LTβ 受体 (LTβR) 结合。该信号通路导致基质细胞分泌血管内皮生长因子C（VEGFC），从而促进HEV的发育，以及粘附分子的分泌，例如血管细胞粘附分子1（VCAM1）、细胞间粘附分子1（ICAM1）、粘膜地址素细胞粘附分子 1 (MAdCAM1) 和 PNAd
ꔷ LTβ-LTβR 信号传导和 LTi 细胞分泌 IL-17 的联合作用导致多种趋化因子的产生，特别是 CXCL12、CXCL13、CC 趋化因子配体 19 (CCL19) 和 CCL21。这些趋化因子一起诱导淋巴细胞上 LTα₁β₂的表达，从附近的HEV 募集淋巴细胞并控制它们组织成T细胞和B细胞区。

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3）抗肿瘤治疗可以
ꔷ 鉴于在许多情况下报告的 TLS 与疾病结果之间的关联，TLS 的诱导可能形成一种有吸引力的治疗策略。通过 TLS 相关细胞因子和趋化因子的组织特异性表达诱导局部 TLS 的可行性，包括淋巴毒素 、TNFα、LIGHT、CXCL13、CCL21、CCL19和 CXCL12，已在小鼠模型中得到证实。
ꔷ TLS在ICB治疗的中具有重要的预测价值。在黑色素瘤、肾细胞癌、软组织肉瘤和尿路上皮癌的预处理活检中发现，在采用PD-1或PD-1联合CTLA-4 进行ICB治疗后，肿瘤部位会出现TLS和活跃的B细胞浸润。类似地，在黑色素瘤ICB应答者的活检中也富集了许多TLS组分，包括记忆样B细胞和浆母细胞样细胞。此外，在晚期NSCLC中，通过TLS中功能失调的PD-1^highCD8⁺T 细胞可以预测阻断PD-1治疗的反应性。
ꔷ 在人类癌症中也观察到独立于免疫检查点阻断治疗（ICB）的 TLS 诱导，新辅助化疗被证明可以促进非小细胞肺癌和肝母细胞瘤的从头 TLS 发展，一些肿瘤抗原疫苗也能达到类似的效果。但在鳞状细胞肺癌中获得了相反的结果，其中新辅助化疗导致 TLS 成熟受损和 GC 损失。目前，尚不完全清楚对 TLS 组织的负面影响是否取决于所使用的化疗类型或类固醇的伴随治疗。

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★ 虽然诱导或增强 TLS 功能可能会改善肿瘤控制，但此类干预措施可能同时会增强其他组织部位的自身反应性 T 和 B 细胞反应。自身免疫反应被认为是 ICB 后的主要毒性类型，包括关节炎、肌炎、甲状腺炎、血管炎和结肠炎。故，提高 TLS 数量或 TLS 功能的方法也可能增加 ICB 诱导的自身免疫毒性。

❀ TLS 在肿瘤特异性免疫反应调节中的作用

越来越多的证据表明，适应性免疫反应也可以在 TLS 中产生或增强。由于目前缺乏有关 TLS 功能的详细信息，提出了许多模型来解释为什么在慢性炎症条件下在感染或癌症部位创建淋巴生态位可能是有利的：

ꔷ Speed：T 细胞和 B 细胞直接从TLS出发诱发更快的免疫反应，免去了在 DC 和淋巴细胞进出 SLO 的运输。（但TLS 在慢性炎症的背景下尤其突出，"Speed"的论点似乎不那么令人信服）。
ꔷ Efficiency：免疫细胞直接驻扎在前线，更有可能发现与之相匹配的抗原，从而诱导更强烈或更广泛的免疫反应。在此模型中，TLS 和 SLO 中诱导的 T 细胞和 B 细胞的功能和表型特性可能相同，但它们靶向的抗原可能部分不同。
ꔷ Control：拥有与发炎组织部位直接接触的淋巴生态位可能会提供额外的机会来引导免疫反应。例如，周围肿瘤组织中产生的细胞因子和/或代谢因子可能会渗透到 TLS，从而影响所产生的免疫反应的性质。
ꔷ Survival：在肿瘤中存在大量功能失调的 PD-1^highCD8 ⁺ T 细胞，TLS的存在可以一定程度上保持T细胞的活性，减轻T细胞的耗竭。这有利于免疫应答的维持，实现对疾病的控制。

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❀ TLS 的预后和预测潜力

ꔷ TLSs与许多癌症（肺癌 、结直肠癌和胰腺癌等）的良好预后相关，且其预后价值通常与肿瘤的TNM（T代表原发灶；N代表淋巴结；M代表远端转移）分期无关。而且，现已证明TLS密度及其组成细胞T_FH细胞、滤泡B细胞、DC-LAMP⁺成熟DC、HEV等与许多肿瘤的存活率相关。
ꔷ 在肿瘤中，TLSs的出现常伴随着免疫浸润的全面增加。与单独CD8⁺ T细胞浸润相比，若同时存在TLSs和活跃的瘤内CD8⁺ T细胞浸润则预后效果更好，这也表明含有TLSs的肿瘤中会产生更好的免疫反应。TLS的成熟状态和其位置异质性会影响其预后价值。
ꔷ TLS位置方面，大多数肿瘤的TLS存在于肿瘤周围，但在HCC、生殖细胞肿瘤和肾细胞癌的肺转移中发现了瘤内TLSs。在HCC中，与瘤内TLSs相比，瘤周TLS常伴随着更高的癌症复发风险和不良的预后效果。然而，在大多数癌症中，TLS的瘤周或瘤内位置与预后之间并无明确联系。
ꔷ 尽管在大多数癌症类型中TLS与良好的预后有关，但在有一些癌症中TLS却与肿瘤发生和进展相关。已有多种潜在的免疫抑制机制可以解释这一观察结果：首先，在小鼠肺腺癌模型中，主要的TLS中的T_reg缺失可以更好地控制肿瘤，表明TLS相关的T_reg可能会抑制内源性抗肿瘤T细胞反应；其次，TLS中的B细胞除了作为肿瘤特异性抗体的生产者之外，也可能通过分泌 IL-10 等机制抑制肿瘤特异性免疫。此外，基于产生的同型抗体和免疫细胞类型，肿瘤特异性抗体可能也可以通过抑制性Fc受体来抑制肿瘤特异性免疫反应；最后，有研究者观察到HCC祖细胞在形成肝癌和转移前首先出现于TLS中，这表明TLS也可能是提供了促进恶性细胞转化和生长的微环境。

参考文献：

1. Tertiary lymphoid structures in cancer (https://www.science.org/doi/10.1126/science.abf9419?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed)

2. Tertiary lymphoid structures in the era of cancer immunotherapy (https://www.nature.com/articles/s41568-019-0144-6)