循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是癌症诊断和预后的潜在标志物，先前的研究已经证明ctDNA甲基化标志物在结直肠癌（CRC）诊断和预后的潜在应用。中山大学肿瘤防治中心骆卉妍教授团队于2021年12月27日在期刊Clin Epigenetics（IF 6.551）发表了题为“Circulating tumor DNA methylation marker MYO1-G for diagnosis and monitoring of colorectal cancer”的研究成果，回顾性研究验证了甲基化生物标志物MYO1-G（cg10673833）在CRC诊断和疾病监测中的价值，揭示cfDNA甲基化标志物MYO1-G可以作为诊断和监测CRC的潜在生物标志物。
背景
据GLOBOCAN数据，结直肠癌（CRC）占全球新发癌症病例的10%，已成为全球第四大癌症死亡原因，CRC早期诊断与更高生存率相关。结肠镜检查是CRC筛查最的推荐方法，但由于其成本和侵入性并非被所有人接受。癌胚抗原（CEA）检查是CRC监测中基于血液唯一可用的非侵入性方法，但由于其敏感性低，有效率有限。此外监测癌症术后复发和治疗反应在CRC诊疗中同样非常重要。因此迫切需要开发一种新的、非侵入性的、更有效的方法用于CRC早期诊断和监测。
然而在目前临床实践中，很少有潜在生物标志物被用于监测治疗反应。先前研究证明ctDNA甲基化标志物对CRC的诊断、预后和监测的有效性，并显示出良好的诊断和预后预测力。作者先前使用801例CRC患者和1021例正常对照组的细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）样本，开发预测诊断（包括9个甲基化标志物）和预后模型（包括5个甲基化标志物）。结果发现CpG位点cg10673833的甲基化状态在CRC的诊断和预后方面显示出高有效性。本研究旨在验证甲基化标志物cg10673833（MYO1-G）在大样本量下使用ddPCR（droplet digital PCR）方法进行CRC诊断和疾病监测的潜在用途。
方法
从中山大学肿瘤防治中心和中山大学附属第六医院共招募402份正常对照组和402份有肿瘤负荷的I-IV期CRC患者的血液样本，使用ddPCR定量检测甲基化水平，以评估MYO1-G甲基化对CRC诊断和监测的潜在作用。
结果
ctDNA甲基化用于诊断和分期
作者将ctDNA检测的样本（CRC:305，对照组:307）和CEA检测进行配对绘制CRC诊断的ROC（receiver operating characteristic）曲线并比较AUC（Area under curve）。比较不同组的甲基化水平，以计算其敏感性和特异性。CRC诊断的ROC曲线结果显示，MYO1-G的AUC为0.94（95% CI 0.93–0.96），表明MYO1-G在区分CRC患者和健康人群方面表现良好，明显优于CEA的AUC（0.87）。CRC患者ctDNA中MYO1-G高甲基化。对于所有具有肿瘤负荷的CRC样本，甲基化标志物MYO1-G在检测CRC时的敏感性为84.3%，特异性为94.5%，阳性预测值（PPV）为93.9%，阴性预测值（NPV）为85.8%。
图1：MYO1-G甲基化和CEA在CRC诊断中的ROC曲线
表1：肿瘤负荷患者和正常对照组样本中ctDNA甲基化水平和CEA的敏感性和特异性
表2：肿瘤负荷患者样本中ctDNA甲基化水平和CEA的敏感性和特异性
考虑到疾病分期，I-IV期的AUC分别为0.98（95% CI 0.95-1.00），0.91（95% CI 0.86-0.97），0.93（95% CI 0.91-0.97）和0.95（95% CI 0.94-0.98）。I-IV期的ctDNA甲基化敏感性分别为85.7%、74.4%、83.2%和86.8%，表明敏感性与疾病分期不相关（P = 0.225，Pearson相关）。I-IV期CRC样本的甲基化水平高于对照组（P<0.001），且I-IV期CRC之间甲基化水平无明显差异。
图3：用于I-IV期CRC诊断的MYO1-G甲基化ROC曲线
图4：对照组和I-IV期CRC样本的甲基水平箱形图
ctDNA甲基化用于疾病监测
随后，作者研究甲基化在评估CRC手术和治疗反应中的作用。结果发现，在治疗后可检测到残留肿瘤（MRD）的CRC患者样本的MYO1-G甲基化水平显著高于未检测到MRD的患者样本（0.18 [IQR:0.12–0.28]vs. 0.13 [IQR:0.08–0.21]，P<0.001)，表明MYO1-G甲基化水平与肿瘤负荷相关。考虑到部分IV期患者手术后存在MRD，作者仅对I-III期CRC患者进行手术评估，总共分析了163例患者的386份CRC血液样本，包括175份术前血样和211份术后血样。在这些样本中，58个样本为患者的单个时间点检测，328个样本为患者长时间监测。对于多个时间点监测的患者，中位随访时间为2.5个月（IQR 1.2-5.2个月）。术后患者的甲基化水平显著低于术前（P<0.001）。表明ctDNA甲基化的动态变化与治疗结果一致。
在IV期样本的治疗反应分析中，32个样本为患者的单个时间点检测，84个随时间监测样本。中位随访时间为3.5个月（IQR 2.1-9.6个月）。与疾病进展(PD)患者相比，治疗反应阳性或稳定（包括完全缓解[CR]，部分缓解[PR]和稳定疾病[SD]）患者的ctDNA甲基化水平显著降低。另外在临界值10%时，100%（19/19）PD样本呈阳性，SD和PR/CR的检测阳性率分别为69.4%（50/72）和60.0%（15/25）。表明MYO1-G甲基化水平与治疗反应相关。
图5：CRC样本中甲基化水平箱线图
图6：甲基化标志物MYO1-G可作为监测CRC的潜在生物标志物
图7：在CRC癌患者血浆样本中，甲基化水平与治疗结果相关
结论
以上研究结果表明，甲基化标志物MYO1-G可以作为诊断和监测CRC的潜在生物标志物，也有可能用于CRC的早期检测，并提供疾病复发和调整治疗策略的证据。
参考文献：
doi：10.1186/s13148-021-01216-0
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