医麦客新闻 -- CAR-T 细胞疗法在血液瘤领域的成功已无需过多赘述，但有不少人认为，自体CAR-T细胞疗法在血液瘤领域已经进入了“过剩”的“内卷”时代。目前获批上市的CAR-T疗法均为自体细胞疗法，这种来自患者自身的细胞可以在患者体内较长时间发挥作用并且不产生排斥反应。但是其制备耗时长、制备成本高，加之许多患者体内没有足够的健康T细胞，使这一疗法面临着诸多挑战问，患者可及性亟待提高。在这种情况下，无论是针对实体瘤还是血液瘤，通用型CAR-T疗法势在必行。
但是，现阶段CAR-T制备依然存在两大技术瓶颈：T细胞获取以及基因转染。这两点也在很大程度上使得CAR-T技术的成本居高不下。如果说开发通用型CAR-T疗法可以解决T细胞获取这一难题，那基因转染的挑战要如何突破呢？
CAR基因转染方法
要将CAR导入T细胞，可以采用多种方法。目前临床上大多使用逆转录病毒或慢病毒等病毒载体来稳定引入CAR。但与此同时，通过非病毒载体依赖的转染方式也在逐渐兴起，为CAR-T细胞制备提供了更多选择。
➤ 病毒载体转染
γ-逆转录病毒载体是第一个用于人类的基因转染系统。这是一种RNA病毒，首先需要通过将包装有CAR基因序列和LTR序列、gag和pol基因系列、env基因系列的三个质粒导入宿主细胞，通过复制/转录出病毒蛋白和目标基因序列，并包装成携带CAR基因的γ-逆转录病毒载体。载体和活化的T细胞膜融合后会释放出CAR基因，CAR基因沿着微管被运输到细胞核，并整合进T细胞基因组之后进行转录表达，从而得到CAR蛋白。
慢病毒是一种来源于人类的免疫缺陷病毒，可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上来实现目的序列的持久性表达。慢病毒载体具有更高的转基因负荷量，且其遗传元件仅在整合后才具备活性，因此基因毒性更小。
但是，病毒载体的尺寸限制了可携带基因片段的大小，同时，这种载体采用随机插入的方式将外源基因整合到细胞基因组中，可能会改变正常基因的表达，存在一定的致瘤风险，并且产品均一性较低；此外，病毒载体的制造过程复杂，所需要的制备时间较长，成本昂贵并且需受到严格控制。所以，科学家们一直在积极开发操作更简便、更安全的转染方法。
➤ 非病毒载体转染
近些年来，非病毒载体正在逐渐兴起，有人认为，非病毒载体正在成为下一代T细胞工程改造中更通用、更灵活和更可持续的方案，目前常用的非病毒载体包括转座子、CRISPR/Cas、mRNA等。这些非病毒载体大多可以采用电转的方式导入T细胞中，可以在很大程度上降低CAR-T细胞制备的成本。
转座子
转座子由一个携带CAR的质粒和一个携带转座子酶的质粒组成，质粒经电穿孔进入T细胞，转座酶被表达后作用于CAR侧翼的末端导致重复序列，导致在T细胞基因组的TA二核苷酸序列上进行切除和整合，插入CAR基因，转录表达后在细胞表面生成CAR。
这种载体可搭载更大的目的基因，实现多目标的需求，同时转座子系统在预激活和休眠的原代T细胞中都能很好的工作，具有低免疫原性和易于生产等优点。常用的转座子系统有睡美人转座子（Sleeping Beauty），PiggyBac等。
相较于病毒载体而言，使用转座子进行转染同样需要较长的时间，插入诱变也会带来一定的安全性问题，同时转染效率要稍逊一筹。但这种方法的免疫原性可以忽略，并且相对而言成本更低，目前临床应用较少。
CRISPR/Cas9
基因编辑技术可以为CAR-T提供一种新的改造方式，而CRISPR/Cas9基因编辑技术是当前使用最为广泛的基因编辑技术，一方面可以用来进行基因敲除，降低CAR-T副作用并且提升其有效性与增殖能力，另一方面也可以通过使用单链DNA（ssDNA）作为同源定向修复模板来敲入目的基因，高效制造CAR-T细胞。
mRNA
mRNA电穿孔是将CAR基因导入T细胞最简单的方法，但是可以转染的基因容量更小，转染效率相对于病毒载体以及转座子而言都要更低。不过这种方法相对而言成本更低，耗时更短，安全性相对较好，没有插入诱变，并且免疫原性可以忽略不计。
无论是mRNA电穿孔还是使用转座子，都需要电穿孔技术将质粒或者外源基因转入T细胞中。传统的电穿孔技术转染效率较低，并且细胞存活率可能不高。
电转技术应用案例
2022年，BLOOD杂志发表了一篇研究性论文，验证了抗肿瘤T细胞中PRDM1的敲除可以增强过继免疫细胞的持久性。在这篇题为“Genetic ablation of PRDM1 in antitumor T cells enhances therapeutic efficacy of adoptive immunotherapy”的文章中，研究人员通过基因转染系统NEPA 21对由Cas9蛋白和sgRNA组成的核糖核蛋白（RNP）复合物进行电穿孔导入细胞中，进行CRISPR-Cas9介导的基因敲除。
2020年，Clinical&Translational Immunology杂志发表了一篇名为“Autologous non-human primate model for safety assessment of piggyBac transposon-mediated chimeric antigen receptor T cells on granulocyte–macrophage colony-stimulating factor receptor”的文章，该实验使用NEPA21高效基因转染系统将携带CAR的转座子导入T细胞中并进行培养，优化了CAR-T细胞的生产程序，并且在猕猴模型中进行了临床前安全性研究，证实了这种CAR-T细胞的杀伤能力以及潜在的肿瘤外效应，并且没有表现出明显的毒性以及细胞因子综合征。
2016年，一篇题为“Co-Expansion of Cytokine-Induced Killer Cells and Vγ9Vδ2 T Cells for CAR T-Cell Therapy”的文章在PLOS ONE发表，该研究同样使用了NEPA21，通过对共扩增细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer，CIK）和γδ细胞（作者称为CIKZ）进行电穿孔转染CD19-CAR mRNA，显着增强了CIKZ细胞的抗伯基特淋巴瘤活性。
大量文献以及数据表明，NEPA21可以在CAR-T细胞转染步骤中提供有力支撑，在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。此外，NEPA21还可以搭配更多的电极，用于神经细胞等的原位贴壁转染，动物、受精卵及宫内胚胎等的活体转染。
小结
CAR-T细胞疗法的热度至今仍未有减少，随着在实体瘤领域难关的逐渐攻克以及通用型CAR-T疗法的研发，这一治疗手段无疑拥有着非常广阔的前景。NEPA21以及进一步提升的电穿孔技术将有助于提升CAR-T转染的效率，推动转座子递送系统以及mRNA电穿孔技术的进一步发展，使其可更广泛地用于商业化生产，从而降低自体CAR-T疗法的成本，助力现阶段CAR-T疗法的破局之路。
参考资料：
1.Yoshikawa T, Wu Z, Inoue S, Kasuya H, Matsushita H, Takahashi Y, Kuroda H, Hosoda W, Suzuki S, Kagoya Y. Genetic ablation of PRDM1 in antitumor T cells enhances therapeutic efficacy of adoptive immunotherapy. Blood. 2022 Apr 7;139(14):2156-2172. doi: 10.1182/blood.2021012714. PMID: 34861037.
2.Morokawa H, Yagyu S, Hasegawa A, Tanaka M, Saito S, Mochizuki H, Sakamoto K, Shimoi A, Nakazawa Y. Autologous non-human primate model for safety assessment of piggyBac transposon-mediated chimeric antigen receptor T cells on granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor. Clin Transl Immunology. 2020 Nov 22;9(11):e1207. doi: 10.1002/cti2.1207. PMID: 33251009; PMCID: PMC7680920.
3.Du SH, Li Z, Chen C, Tan WK, Chi Z, Kwang TW, Xu XH, Wang S. Co-Expansion of Cytokine-Induced Killer Cells and Vγ9Vδ2 T Cells for CAR T-Cell Therapy. PLoS One. 2016 Sep 6;11(9):e0161820. doi: 10.1371/journal.pone.0161820. PMID: 27598655; PMCID: PMC5012695.
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