5.18日PNAS（If 9.412）接收弗吉尼亚大学医学院的文章，该研究运用CRISPR/Cas9敲除文库（Human Lentiviral sgRNA Library - Nuclear）在胰腺导管腺癌的人源肿瘤异种移植模型（Patient-Derived tumor Xenograft，PDX）（未经过体外培养，较好地保持了原发肿瘤的遗传特性和异质性）筛选，并鉴定了PRMT5作为吉西他滨（Gem）的合成致死联合靶标。
01 胰腺癌临床现状
02 文章思路
03 候选基因筛选方案
CRISPR/Cas9 文库筛选方案：
1）文库：Human Lentiviral sgRNA Library-Nuclear(8031sgRNA，619靶基因)。
2）靶细胞：患者胰腺癌分离PDX366，低分化转移肿瘤，低基质含量，KRAS、P53、SMAD4突变。
3）筛选流程：0.25 MOI感染50-100百万cells,药筛后cells随机分为9批（200万/批），1批为day0,其余用于体外和体内（原位，200万/只）筛选；体内接种一周后，对照和实验组被给药5周；体外细胞每3天给药IC50持续5周。
4）体内和体外模型中，筛到的基因中接近1/3的基因是模型特异的，从交集中筛选候选基因。
候选基因筛选标准：
1）在体内和体外模型中显著下调；
2）候选基因有现成的抑制剂，如PRMT5小分子抑制剂EPZ015666、EPZ015938；
3）有潜在治疗价值；
4）高表达促癌。
5）靶基因KO联合Gem合成致死PDCA得分最高。
04 研究结果
1）单基因KO +Gem合成致死PDAC
蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）能够使多种蛋白（包括组蛋白和非组蛋白）甲基化，并影响多种生物学过程。本研究发现PRMT5 KO联合Gem抑制PANC-1、mPanc96细胞增殖；靶向PRMT5的小分子抑制剂联合Gem也观察到相同的结果：24个剂量组合，联合指数（CI＜1协同效应；=1叠加效应；≥1.2拮抗效应）具有协同效应的占80%，即显著抑制细胞增值；PRMT5 KO细胞恢复PRMT5表达，细胞活性显著提高。
2）PRMT5 KO介导Gem敏感性增强的潜在机制
PRMT5作为转录调控因子，在Gem模型中，PRMT5 KO是否引起不同的转录调控？
转录组测序发现，cell cycle，DNA repair通路被异常激活。通过细胞增值和WB检测DNA损伤指标发现，PRMT5 KO或抑制剂处理显著上调DNA损伤指标蛋白水平，但RPA2蛋白下降60-70%，其细胞阻滞在G2M期、sub-G1。
3）抑制PRMT5导致RPA耗竭
RPA表达量下调是否由PRMT5调控？
随着PRMT5抑制剂处理浓度和时间增加，RPA表达量逐渐降低；恢复RPA表达，PRMT5 KO细胞对Gem敏感性增强。
4）PRMT5 KO通过影响DNA修复，导致大量DNA损伤积累
研究者通过免疫荧光和彗星实验观察到，PRMT5 KO或抑制剂联合Gem促进DNA损伤；通过同源修复报告基因实验发现小分子抑制剂联合Gem显著抑制同源重组修复效率（HDR）。
5）联合治疗协同抑制肿瘤生长
PRMT5 KO或抑制剂联合Gem协同抑制肿瘤生长，药物治疗组的DNA损伤指标显著上调；
综上所述，研究者利用CRISPR个性化文库在PDAC的PDX体内模型筛选出Gem耐药候选基因-PRMT5，通过抑制DNA的同源修复促进DNA损伤，从而增强PRMT5 KO肿瘤细胞对Gem的化疗敏感性，为临床提供一种新的，更有效的治疗方案。
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