免疫检查点阻断治疗法目前已应用于多种乳腺癌亚型的治疗，但是患者的免疫应答具有异质性。这种决定治疗效果异质性的机制和标志物的鉴定是该领域的研究重点。本研究中，研究者通过单细胞转录组+TCR测序技术对接受抗PD1治疗的乳腺癌患者治疗前、中样品进行分析，探究治疗前后肿瘤内细胞表达特征的变化。
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文章题目：A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer.
中文题目：乳腺癌患者抗PD1治疗期间肿瘤内变化的单细胞图谱
发表时间：2021.5
期刊名称：Nature Medicine
影响因子：36.131
实验平台：10x Genomics Chromium（5‘表达文库+TCR VDJ富集文库）、CITE-seq
样本类型和数量：激素受体阳性或三阴性乳腺癌患者的治疗前和治疗中配对的活检样品，接受抗PD1治疗患者（n=29）和新辅助化疗后接受抗PD1治疗患者（n=11）
DOI：10.1038/s41591-021-01323-8
研究背景
三阴性乳腺癌（TNBC）在乳腺癌（BC）患者占约15%，且其中具有大量肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），说明免疫检查点阻断（ICB）可能是针对TNBC的较好的治疗方式。而新辅助化疗期间加入抗PD１治疗早期TNBC可增加病理完全缓解率和无事件生存率。此外，新辅助ICB疗法还可用于BC其他亚型（ER＋和HER２-）。然而，并不是所有BC患者都能对新辅助ICB疗法应答，因此探究其中的原因和鉴定能决定治疗效果的相关标志物就成为亟待解决的问题。很多研究表明，T细胞的克隆性扩增是ICB治疗反应的基础，使用单细胞测序技术可获得T细胞扩增的模式和机制。然而，目前的研究都只着眼于容易获得的样品、较少的患者数或只专注于CD45+免疫细胞。因此，研究者使用单细胞转录组测序，单细胞TCR测序和CITE-seq方法对40例患者组织进行测序，以达到鉴定BC患者ICB治疗应答机制的目的。
研究内容
// 抗PD1治疗前和治疗中的单细胞图谱分析
研究者所用的两个研究队列：１.未经治疗的非转移性原发性乳腺浸润癌患者在手术前大约９±２天接受pembrolizumab（Keytruda或抗PD1）治疗；2.接受了为期20-24周的新辅助化疗，随后在手术前接受了pembrolizumab治疗。在两个队列中，“治疗前”样品指在抗PD1治疗前立即收集的活检组织，“治疗中”样品指在手术中收集的，包含了不同的BC亚型患者。
针对队列1的配对样品使用单细胞免疫组库测序（转录组+TCR），获得了恶性乳腺上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞。其中，恶性乳腺上皮细胞拷贝数不稳定，且在患者中的分布具有特异性，治疗前、中的组织或不同BC亚型之间没有聚类偏倚。TCR结果分析发现9名患者的配对样品均发生克隆性扩增，研究者命名其为“E（s）”，其他20名命名为“NE（s）”。治疗过程中一些克隆型消失了，说明T细胞发生了克隆型收缩，不过克隆型收缩没有克隆型扩增明显，且在Es和NEs中平均分布。值得注意的是，有些NE（n=11）治疗前T细胞比例较高，但在抗PD1治疗后不能扩增。其余的NEs 的T细胞频率较低而且也不能扩增。此外，治疗中样品里61%的扩增T细胞的克隆型在治疗前就已存在。
Fig 1. 实验设计、细胞注释和T细胞表现型
// 表达PD1的T细胞在抗PD1治疗后增殖
接下来，研究者根据不同分组比较单细胞转录组结果。治疗前，成纤维细胞多见于NEs中，T细胞则多见于Es中。治疗中，癌细胞和成纤维细胞在NEs中更多见，T细胞在Es中进一步富集。对T细胞做亚亚群分析鉴定到表达PD1的CD8+和 CD4+细胞群（具有耗竭样特征的活化T细胞），并命名为TEX cells。研究者还鉴定到一个高度增殖的T细胞组成的PD1+细胞群，在治疗前、中相对丰度高，且在治疗过程中增加。在治疗中，扩增T细胞主要由CD4+和CD8+TEX 细胞组成，但也有一部分CD8+效应/记忆细胞。Es与NEs相比，治疗前、中样品的T细胞克隆性和Gini指数增加，TEX cells克隆性最强，而克隆型丰度则恰好相反。此外，通过CITE-seq证实Es治疗前T细胞的PD1蛋白表达增加。总之，PD1+T cells的比例与T细胞扩增相关，CD8+和CD4+TEX 细胞是抗PD1治疗后主要的扩增T细胞。
// 沿CD８＋TEX或CD4＋TH1、TFH细胞轨迹的T细胞扩增治疗后增殖
研究者构建了CD8+T细胞的伪时间轨迹。TN细胞是轨迹的起点，连接TEM细胞，随后出现三条分支：TEX1和TEX2、TRM、TEMRA。Es与NEs相比，无论是治疗前和治疗中，TEX细胞更多见于轨迹的末端。Es治疗中的TEX细胞具有更多的“显著效应活性”和“短暂/早期耗竭”特征。此外，在所有轨迹中，Es比NEs具有更少的TCR丰度，与治疗前相比，治疗中的TCR丰度减少更明显，说明抗PD1诱导T细胞扩增。扩增的TEX细胞在轨迹末尾处富集，尤其是治疗过程中。
在CD4+T细胞轨迹中，TEX细胞分裂成TH1和TFH细胞。轨迹从TN1出发，向TN2移动，随后是TEM1-3，然后分裂成TH1或TFH细胞。NEs中的这2类细胞治疗前和治疗中都保持早期的前效/记忆状态，而Es治疗中，T细胞活性和早期耗竭标志物表达增加。TCR丰度在接近轨迹末端时下降，尤其是在Es的TH1细胞里。而在Es治疗中，增殖在接近末端时增加。当沿着轨迹比较扩增和非扩增的CD4+T细胞时，TH1和TFH细胞在轨迹末期富集，尤其是Es治疗中。总体而言，TH1和TFH细胞对克隆型扩增有重要贡献，表明它们支持CD8+ TEX细胞正在进行的效应功能。另外，沿着CD8+TEX细胞或CD4+TH1细胞轨迹分析基因表达模式，发现了Es和NEs中表达或激活的差异基因和信号通路。
Fig 2. CD8+和CD4+T细胞轨迹分析
// T细胞表达特征预测T细胞扩增
将治疗前扩增和非扩增T细胞比较筛选差异基因并结合GSEA分析发现，非扩增T细胞更加naive，而扩增T细胞则具有效应功能、免疫细胞归巢、细胞毒性、抗原提呈特性，同时也主要表达免疫检查和肿瘤反应性T细胞marker基因。克隆型扩增的数量也与这些基因及其相关通路有关。治疗前Es与NEs相比，免疫检查标志物和CD4+TH1活性预测T细胞扩增效果最好。CITE-seq结果证实NEs中的naive T细胞标志物表达更高，而免疫检查点、肿瘤反应性和共刺激标志物表达更低。将TNBC Es（n=5）与ER+BC（n=3）比较发现扩增的克隆型数量没有差异，但TNBC中，治疗前T细胞的PD1表达和增殖T细胞数量更高。与ER+Es比较，TNBC中扩增性CD8+T细胞效应功能上调，而其中的CD4+T细胞上调表达抗原提呈基因。相反地，ER+Es的扩增性CD8+、CD4+T细胞过表达naive和前效相关标志物，说明与TNBC相比虽然T细胞扩增程度相似，但分化程度较低。
Fig 3. BC和BC亚型中的扩增性与非扩增性T细胞比较
// 新辅助化疗和抗PD1治疗后的T细胞扩增
研究者使用相同研究策略分析队列２的治疗前和治疗中样品，得到了3名Es。在Es中，T细胞和pDCs增多，在治疗前、中样品，PD1表达和CD4+及CD8+TEX细胞均增多。比较治疗前扩增和非扩增T细胞，发现了与只接受抗PD1的患者相似的差异基因或信号通路。TH1活性和其中的50个特征差异基因可有效预测T细胞扩增，证明当新辅助化疗与抗PD1结合时，CD4+TH1细胞也参与T细胞扩增。
// 树突状细胞（DC）和巨噬细胞与T细胞扩增的关系
将队列1患者得到的DC再分群获得了6个DC亚群。与NEs相比，Es的PD-L1和PD-L2表达量增加，在DC中，PD-L1只在mregDC亚群表达。Es治疗前的mregDC相对频率较高，而其他类型DC的相对频率在Es与NEs的治疗前样品中并无太大差异。pDC、ASDC和mregDC在Es治疗中数量更多。此外，研究者还筛选了Es与NEs治疗前、中的差异基因涉及的功能及通路。总之，DC在ES中，无论治疗前还是治疗中，都具有免疫应答功能且支持T细胞功能。
与DC类似，巨噬细胞表达PD-L1和PD-L2，在治疗前，这两个基因、几个细胞因子（CXCL9等）和I/II型干扰素应答基因在ES中的上调表达，而CX3CR1和C3下调表达。
Fig 4. 表达PD-L1的树突细胞与巨噬细胞与T细胞扩增的关系
// T细胞扩增的肿瘤中，癌细胞受抗PD1治疗影响
在Es中，癌细胞数量随治疗变少。尽管在癌细胞中未能检测到PD-L1的表达，但大量抗原提呈MHC I/II型基因在NEs中下调表达，与NEs相比，抗原加工及提呈和IFN-γ 应答信号通路在Es中上调表达。将Es治疗前、中相比较发现，治疗中的癌细胞具有一种持续的抗肿瘤反应，且富集细胞增殖、蛋白水解、细胞死亡、免疫信号和细胞毒性通路。最后，研究者分析了各类细胞的相对频率与T细胞扩增的相关性，并使用CellphoneDB分析配体受体互作关系，确认了不同样品细胞内的共刺激与共抑制作用。
主要结论
本研究对象为在手术前进行抗PD1治疗的激素受体阳性或三重阴性（TNBC）的乳腺癌（BC）患者，针对只接受抗PD１治疗的患者（29例）或先接受新辅助化疗后再接受抗PD1治疗的患者（11例）的活检组织（治疗前和治疗中的配对组织），进行单细胞转录组、TCR和蛋白组分析。主要结论如下：
1. 三分之一肿瘤包含表达PD1的T细胞，这些T细胞在抗PD1治疗后发生克隆性扩增，而与肿瘤亚型无关。扩增主要涉及CD8+T细胞（显著表达细胞毒性、免疫细胞归巢和耗竭标志物）和CD4+T细胞（表达T-helper-1和follicular-helper标志物）。
2. 在治疗前活检组织中，免疫调节性树突状细胞（PD-L1+）、特异性巨噬细胞表型（CCR2+、MMP9+）和主要组织相容性复合体I/II类表达的癌细胞的相对频率与T细胞扩增呈正相关。
3. 未分化的前效/记忆T细胞（Tcf7+、GZMK+）或抑制性巨噬细胞（CX3CR1+、C3+）与T细胞增殖呈负相关。
这些数据分析结果确定了各种免疫表型和相关基因集，它们与抗PD１治疗后T细胞扩增呈正、负相关，并阐明乳腺癌患者抗PD1治疗响应的异质性特征。
参考文献
Bassez, Ayse et al. “A single-cell map ofintratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer.”Nature medicine vol. 27,5 (2021): 820-832.
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