插入位点选择：Safe Harbour Sites，安全插入位点。
组织特异性表达启动子
诱导型启动子：为Cre系统增加时间特异性
四环素系统（Tet-Off System / Tet-On System）
由四环素（tetracycline）或其衍生物多西环素（强力霉素Dox）控制转录激活子tTA或rtTA与启动子Ptet结合，从而调控下游基因的表达
Tet-Off / tTA依赖（tetracycline-controlled transactivator protein (tTA) dependent）
加药刺激后关闭启动子
Tet-ON / rtTA依赖（reverse tetracycline-controlled transactivator protein (rtTA) dependent）
加药刺激后开启启动子
他莫昔芬系统（Tamoxifen System）
Cre重组酶与突变的雌激素受体（ER）的配体结合域融合，形成Cre-ERT。Cre-ERT不再与它的天然配体β雌二醇结合，而与合成配体他莫昔芬结合。
不加他莫昔芬时，Cre-ERT融合蛋白分布于细胞质中并结合热激蛋白如Hsp90，抑制受体临近结构域的功能，复合体定位于细胞质中不能进入核。
加入他莫昔芬，Hsp90被从从ER中替换出来，ER受体转变为活性状态，暴露出核定位信号，Cre重组酶能进入核中并行使其功能。
Tamoxifen诱导系统
Cas9：具有两个核酸内切酶结构域HNH和RuvC
PAM：protospacer adjacent motif. SpCas9 PAM=NGG
相对结构： sgRNA互补链为Target被HNH剪切，非靶标链含有PAM序列被RuvC剪切
以SpCas9为例
D10A突变使RuvC结构域失活，仅切割靶链
0
H840A突变使HNH结构域失活，仅切割非目标链
Cas9结构
Cas9结构
2018 Sci Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR/Cas9-induced genetic scars
动物：斑马鱼zebrabow M(在所有细胞中具有32个表达RFP的位点)
方法：单细胞阶段向胚胎注射了2 nl Cas9蛋白和靶向RFP的sgRNA进行突变
2018 Sci Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR
动物+方法：生成了具有60个归巢向导RNA（hgRNA）的嵌合小鼠靶向其自身基因座导致多种突变结果。
2018 Sci Whole organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing
动物+方法：细胞中导入对应一个sgRNA的10个连续的Cas9靶区域。10个序列逐渐突变，与sgRNA亲和力逐渐减弱。
参考：
https://zhuanlan.zhihu.com/p/52679847
Zhang et al.Conditional gene manipulation: Cre-ating a new biological era.Journal of Zhejiang University-SCIENCE B (Biomedicine & Biotechnology). 2012 13(7):511-524
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