Integrated Proteogenomic Characterization of HBV-Related Hepatocellular Carcinoma

乙肝相关肝细胞癌的综合蛋白质组学表征

期刊：Cell；影响因子：38.637

发表单位：复旦大学附属中山医院等

导 读

    肝细胞癌（HCC）约占所有原发性肝恶性肿瘤的85％-90％，较大归因于乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染，以及酗酒和代谢综合症。与HBV相关的肝癌约占中国肝癌病例的85％。先前的基因组、转录组学研究已经揭示了肝癌的遗传格局，包括TP53、CTNNB1、TERT启动子和其他关键基因位点中的驱动程序突变。然而，遗传改变如何驱动HBV相关肝癌中的癌症表型仍然未知。

    基于质谱（MS）的蛋白质组学可以测量整体蛋白质丰度和翻译后修饰，以提供了更全面的图谱，可通过功能蛋白质组学和信号网络将癌症的基因型与表型联系起来。2019年10月发表在《Cell》的一项研究中，首次对HBV相关肝癌进行了蛋白质基因组学鉴定。通过对来自中国的159例感染HBV的肝癌患者的癌组织和配对癌旁肝组织样本进行基因组、转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组研究，揭示了多组学之间的联系和不一致性，以及关键信号和代谢途径的改变。同时，研究还发现了蛋白质组数据整体上可以分为三个不同的亚型，这些亚型显示出与患者生存率、个性化治疗和肝癌特异性特征相关。该项研究不仅提供了与TCGA互补的HBV相关肝癌的高质量蛋白质组学资源，而且还暗示了有希望的预后和治疗意义以及可能有益于临床实践的潜在调节机制。

摘 要

    研究首次对来自159名患者的配对肿瘤和邻近肝组织进行了乙型肝炎病毒（HBV）相关肝细胞癌（HCC）的蛋白质基因组学特征分析。整合的蛋白质组学分析显示，在HBV相关的肝细胞癌中，关键信号通路的激活状态以及肝脏特异性代谢重编程之间存在差异。蛋白质组学分析确定了与临床和分子属性相关的三个亚型，包括患者存活率、肿瘤血栓、遗传谱和肝脏特异性蛋白质组。这些蛋白质组亚型在代谢重编程、微环境失调、细胞增殖和潜在的治疗方法中具有独特的特征。两种预后生物标志物PYCR2和ADH1A与蛋白质组有关，并参与肝细胞癌代谢重编程，揭示了CTNNB1和TP53突变相关的信号和代谢谱，其中经突变的CTNNB1相关的ALDOA磷酸化被证实可促进糖酵解和细胞增殖。本研究提供了宝贵的资源，可极大地扩展与HBV相关的肝细胞癌的知识，并可能最终有益于临床实践。

强 调

    蛋白质组亚型对患者生存进行分层并分配特定的治疗方法；

    鉴定肝癌中肝特异性蛋白质组和代谢的变化；

    描绘了肝癌关键信号传导和代谢途径的多组学概况；

    CTNNB1突变相关的ALDOA磷酸化促进肝癌细胞增殖。

研究概要

1    CHCC-HBV样品的全面蛋白质组学表征

    作者对159例肝细胞癌患者（称为CHCC-HBV队列）的配对肿瘤和非肿瘤肝组织进行外显子组、转录组、蛋白质组和磷酸蛋白组学分析。蛋白质组定量了10783个蛋白质，磷酸蛋白组分析从9224个磷蛋白中鉴定出59746个高度可靠的磷酸位点，最终选择了6494个蛋白（由6478个基因编码，在所有159个配对样品中定量）和26418个磷酸化位点（在至少一半的样品中进行了量化）进行了后续分析。通过全外显子测序，肿瘤与非肿瘤肝的比较确定了10235个突变基因，包括20369个非沉默点突变和1363个插入缺失。转录组和蛋白质组学数据配对创建了6203个mRNA-蛋白对，显示总体正相关，参与代谢过程的基因具有最强的mRNA-蛋白相关性，而参与细胞周期和mRNA过程具有较弱的相关性。特别是，参与呼吸链复合物I组成的基因在mRNA和蛋白质丰度之间存在显著不一致，表明复合物的形成可能会减弱基因组/转录组变异引起的蛋白质丰度变化。

2    CHCC-HBV的蛋白质组学景观

    作者鉴定出5个显著突变的基因，包括TP53（58％）、CTNNB1（19％）、AXIN1（18％）、KEAP1（7％）和RB1（6％）。与TCGA相比，CHCC-HBV突变谱存在不同。主成分分析（PCA）进一步确定了CHCC-HBV队列和TCGA HCC样本的显著分离，突出了病毒感染对肝癌发生中突变特征的潜在影响。

    先前研究报道了含有马兜铃酸（AA）的中草药是包括HCC在内的致癌作用的促成因素。由于多达80％的CHCC-HBV患者可能接受了中草药治疗肝炎，作者通过外显子数据确定了AA暴露的特征，主要体现在A:T>T:A转化。根据蛋白质组学数据，鉴定出了来自该标记的三种肽，表明AA相关的基因组交替确实可以产生突变的蛋白质。由于AA可能导致DNA损伤和体细胞突变，包含AA签名的肿瘤中的肿瘤突变负荷、新抗原计数以及CD8+T细胞浸润均比非AA肿瘤更高，这提示对这些患者的免疫疗法样检查站封锁具有潜在的益处。此外，AA标记与肿瘤血栓、血清白蛋白水平、移码Indel和肝癌阶段呈负相关。这些结果表明，具有AA特征的HBV相关肝细胞癌是一个具有特殊临床病理和分子特征的患者亚群。

图1，乙肝相关肝癌队列的突变谱。（A）所有159例HCC患者的遗传特征和相关的临床病理特征；（C）在159例肿瘤中的56例中鉴定出AA标志突变；（D）AA签名的肿瘤中突变负荷和新抗原水平；（E）AA签名的肿瘤中CD8+T细胞和免疫调节分子水平。

3    拷贝数变异的影响

    体细胞拷贝数变异（SCNA）显示染色体1q和8q的扩增最频繁，染色体4q、8p、16p、16q和17p的丢失最为频繁。并观察到伴随的驱动癌基因扩增，包括CCND1、FGF19和TERT，以及抑癌基因缺失，例如AXIN1、CDKN2A/CDKN2B、RB1和TP53。通过分析CNA对基因表达的顺式和反式影响，揭示了CNA-mRNA和CNA-蛋白质缔合的强大磷蛋白水平缓冲作用，以及RNA丰度比蛋白丰度与CNA变化的相关性更好。蛋白质复合物装配可能在翻译后修饰和确定蛋白质半衰期中起重要作用，从而导致转录物与蛋白质丰度之间的相关性降低。

    4q和16q在整个队列中主要共同缺失，且与蛋白丰度有关，表明它们可能在肝癌发生过程中共同调节基因表达。基因集富集分析（GSEA）显示，4q和16q相关的蛋白质集中在RNA相关的转录、剪接、运输，以及细胞周期和蛋白介导的蛋白水解途径。4q和16q缺失对许多泛素-蛋白酶体系统（UPS）基因表现出顺式效应，对细胞周期主调控因子表现出反式效应，其蛋白表达与4q和16q拷贝数呈显著负相关，表明4q和16q的缺失可能通过顺式和反式效应促进了整体蛋白表达的改变和肿瘤的进展。

图2，拷贝数变化对mRNA和蛋白质丰度的影响。（A）热图显示具有CNA顺式和反式效应的CNA与mRNA（左）和蛋白质（右）表达的相关性，与特定CNA显著相关的mRNA和蛋白质的数量在相应面板下方以条形表示；（E）在4q和16q染色体上负相关的CNA-蛋白质的蛋白富集分析；（F和G）染色体4q（F）和16q（G）的拷贝数丢失以及UPS和细胞周期相关蛋白的mRNA/蛋白丰度的热图。

4    基于蛋白质丰度的CHCC-HBV肿瘤聚类

    考虑到蛋白质组学数据能够比转录组学数据更好地反映了基因功能，作者基于肿瘤和非肿瘤肝脏之间差异表达的蛋白质进行了无监督聚类，将肿瘤队列分为3个亚型。亚型1（代谢亚型）的特征是与代谢有关的蛋白质和肝功能保留最高水平，亚型3（增殖亚型）的特征是增殖相关蛋白的增加，亚型2（微环境失调的亚型）具有代谢和增殖蛋白的中间表达，以及下调的免疫、炎性和基质蛋白。类似地，基于磷酸蛋白质组学数据还将肿瘤分为与蛋白质组学亚型一致的3个亚型。

    高频突变基因RB1和TSC2在代谢和增殖亚型中显示出明显的富集。增殖亚型高表达免疫和炎症相关的蛋白，与更大的肿瘤尺寸、肿瘤血栓和晚期TNM分期有关，且预后最差。肿瘤血栓是肝细胞癌中最重要的临床病理特征之一，作者还比较了有或没有血栓的肿瘤之间的蛋白质组学特征，差异表达的蛋白调节代谢重编程、过氧化物酶体和肝功能，进一步支持了肝癌新陈代谢失调的关键作用。由于代谢亚型具有最高的突变负荷和新抗原负荷，因此此类患者可能会从免疫检查点封锁中受益更多。总之，这些与肝细胞癌相关或特异的基因与蛋白质组学亚型显著相关，进一步突显了它们的临床意义。

图3，乙肝相关肝癌的蛋白质组学分层及其临床病理相关性。（A）基于肿瘤组织和非肿瘤组织之间差异表达的蛋白质的患者分组；（B）基于蛋白质组的总体生存率的Kaplan-Meier曲线；（C）在不同的TNM阶段的总生存率的Kaplan-Meier曲线；（D）TCGA HCC队列的生存分析。

5    鉴定和验证预后生物标志物

    作者通过有监督的层次聚类确定代表性的预后蛋白，得到3个上调蛋白和39个下调蛋白，主要富集在氨基酸代谢和氧化还原酶活性的通路上。作者选择了PYCR2（氨基酸代谢）和ADH1A（氧化还原酶活性），它们显示出明显的差异表达且与患者预后密切相关，并通过组织微阵列免疫染色进一步表明了它们对潜在临床应用的可靠预后价值。高PYCR2患者更多出现在微环境失调和增殖亚型中，并具有肿瘤血栓和大肿瘤的特征，表现出与代谢和过氧化物酶体相关的通路的特定下调，而涉及DNA复制、RNA转运和错配修复的通路上调。高ADH1A患者的TP53较少突变，较低的AFP水平和无肿瘤血栓，在涉及代谢、过氧化物酶体和肝功能的途径中显示出特定的升高，并在与剪接体、RNA转运、DNA复制和细胞周期相关的途径中下调。综上所述，显示相反调控方向的两个肝细胞癌富集的预后生物标志物与关键的临床病理特征和生物学途径一致。

图4，蛋白质组学预后生物标志物的鉴定和验证。（A）预后蛋白的鉴定流程；（B）PYCR2和ADH1A在肿瘤和非肿瘤组织之间蛋白质组的相对丰度；（C）PYCR2和ADH1A基于蛋白质组学丰度或免疫染色评分的总体存活率的Kaplan-Meier曲线。

6    剖析HBV蛋白和肝特异性蛋白质组

    由于所有患者均为HBV阳性，作者调查了HBV相关因素（包括病毒蛋白和HBV受体）的临床和生物学相关性。在蛋白质组和转录组数据中均检测到大包膜蛋白、外部核心抗原/衣壳蛋白和聚合酶蛋白。肿瘤中HBV受体SLC10A1的蛋白质和mRNA水平明显降低，并与预后有关。由于SLC10A1是一种肝特异性蛋白，主要起着胆汁酸共转运蛋白的作用，因此胆汁酸代谢失调与HBV相关的肝细胞癌之间存在普遍的内在联系。综合分析显示胆汁酸代谢中大多数关键蛋白质均急剧下调，特别是在微环境失调和增殖亚型中。胆汁酸代谢和HBV转录/复制在很大程度上受同一套转录因子（包括FXR、RXR和其他几种转录因子）控制，此类转录因子的功能受损将有助于抑制胆汁酸代谢并同时降低HBV基因表达，这是HBV相关肝细胞癌的独特分子特征。大部分肝特异性蛋白在肿瘤中被下调，而胆固醇代谢的关键酶和谷氨酰胺代谢相关蛋白在肿瘤中表达上调。脂肪酸-胆固醇酯的合成代谢在更多的增殖亚型肿瘤中得到增强，表明谷氨酰胺代谢可能在微环境失调和增殖亚型肿瘤中更活跃。总的来说，这些数据表明在HBV相关的肝细胞癌中肝脏特异性代谢的整体重编程。

图5，HBV相关的肝癌中的HBV受体和胆汁酸代谢被下调。（D）基于SLC10A1蛋白丰度或免疫染色评分的总体生存率的Kaplan-Meier曲线；（F）基于独立HCC队列中SLC10A1的免疫染色评分的总体生存率的Kaplan-Meier曲线；（G）胆汁酸代谢中关键转录因子、酶和转运蛋白的综合分析，绘制了肿瘤中蛋白质的丰度，热图代表肿瘤/非肿瘤、蛋白质组学之间的比较的p值，条形图根据人类蛋白质图谱的数据显示了肝脏在所有其他器官中富集这些蛋白质的情况；（J）肝特异性功能中差异表达的蛋白质的热图和定量分析。

7    细胞代谢和信号通路的蛋白质组学分析

    为了获得对细胞代谢和信号通路失调的一般认识，作者整合了所有159例患者的多组学数据。在肿瘤中观察到糖酵解途径的关键酶（HK2、ALDOA，PKM2等）的显著上调，表明肝癌对葡萄糖代谢的需求增加。诸如ACLY、ACSL3和ACSL4之类酶的表达和磷酸化增加，支持了肝癌中脂质生物合成的整体活化。在转录组、蛋白质组和磷酸蛋白质组水平上观察到胆固醇-胆汁酸代谢途径中大多数关键酶的下调，表明肝细胞癌细胞中肝特异性代谢功能受损。TGF-β/ SMAD2/3可以直接抑制ADH1A的表达，肿瘤中SMAD2/3磷酸化的增加暗示了TGF-β途径的普遍激活，这与ADH1A的下调相一致。

    亚型特异性途径富集分析清楚地证明了三个蛋白质组中亚型的独特分子特征。代谢亚型在TCA循环、异生物代谢、脂肪酸-脂代谢等方面较高，表明该亚型中的肿瘤可能是由代谢过程加快所致。微环境失调亚型更有可能由包括WNT、Notch、Myc和Hedgehog在内的增殖信号驱动，因此拥有最高的细胞更新途径，例如细胞周期、转录、剪接和泛素蛋白水解。在CTNNB1突变的肿瘤中，包括ALDOA和ENO1在内的关键代谢酶的磷酸化被上调，表明CTNNB1激活可能会在翻译和翻译后水平上影响肝细胞癌细胞的代谢重编程。

图6，乙肝相关肝癌的代谢和信号通路被改变。（A）基于综合蛋白质组学分析的代谢和信号通路概述，显示了肿瘤的mRNA、蛋白质和磷酸化丰度的改变。

8    CTNNB1突变相关的ALDOA磷酸化促进肝癌中的糖酵解代谢和细胞增殖

由于基因CTNNB1的活性会影响肝细胞癌细胞的代谢重编程，作者比较CTNNB1缺失突变型和野生型肿瘤的差异磷酸化蛋白质，发现CTNNB1突变型中糖酵解代谢相关的蛋白ALDOA Ser36的磷酸化显著增加。这提示ALDOA Ser36磷酸化调节CTNNB1中的糖酵解代谢突变的肝细胞癌，作者通过试验作了验证。异位表达ALDOA的细胞显示出更强的糖酵解代谢和增殖作用，异种移植小鼠模型中形成更大的肿瘤，支持S36磷酸化在促进ALDOA功能和细胞生长中的作用。敲低ALDOA具有更显著的抗增殖作用，表明ALDOA活性对于CTNNB1突变的肝癌细胞支持其生长的重要性。总之，包括ALDOA在内的糖酵解酶的磷酸化可能会驱动CTNNB1突变的肝癌中的代谢重编程和增殖。

图7，ALDOA-Ser36磷酸化驱动HCC细胞糖酵解和增殖。（A）具有CTNNB1突变的肿瘤中的ALDOA-Ser36磷酸化上调；（C）含肽的S36磷酸化的代表性光谱；（M）描述ALDOA磷酸化在CTNNB1突变的HCC细胞中的功能影响的简要模型。

讨 论

    综上所述，当前的工作是使用多种蛋白质组学平台对CHCC-HBV进行全面而综合的分析。研究发现，代谢改变可能是与疾病晚期和不良临床预后相关的最重要因素。靶向癌症代谢可能为开发有效的肝癌治疗方法提供有希望的途径。研究不仅产生了可能有益于基础研究的高质量数据资源，而且还提供了肝癌临床特征基础的其他生物学见解。