1. 氧化磷酸化
2. 线粒体呼吸链
3. 氧化磷酸化抑制剂
3.1 线粒体呼吸抑制剂
3.2 磷酸化抑制剂
3.3 解偶联剂
4. Seahorse
Seahorse能量代谢分析仪是一种用于测量细胞能量代谢的仪器，可以通过测量细胞的耗氧率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）来评估细胞的线粒体功能、糖酵解和氧化磷酸化等过程。
OCR（Oxygen Consumption Rate）：OCR是指细胞对氧气的消耗速率。Seahorse能量代谢分析仪通过测量细胞周围培养基中的溶解氧含量的变化来确定OCR。在测量过程中，细胞被置于特定的耗氧试剂中，如噻唑类化合物（例如，琥珀酸、马拉酸和氰化钠）。这些试剂会与细胞内的线粒体呼吸链相互作用，导致氧气消耗速率的变化。Seahorse能量代谢分析仪通过测量耗氧试剂与细胞周围培养基中溶解氧含量的变化，计算细胞的OCR。
ECAR（Extracellular Acidification Rate）：ECAR是指细胞外酸化速率，也可以理解为细胞产生的酸性代谢产物的释放速率。Seahorse能量代谢分析仪通过测量培养基中pH值的变化来确定ECAR。在测量过程中，细胞被置于特定的酸化试剂中，如葡萄糖和丙酮酸盐。这些试剂会导致细胞糖酵解过程中乳酸的产生，从而引起培养基pH值的变化。Seahorse能量代谢分析仪通过测量培养基中pH值的变化，计算细胞的ECAR。
OCR和ECAR的测量原理：
http://lwldevelopment.com/newsinfo/1611759.html
4.1 OCR
（A）基础呼吸（Basal respiration）：用于满足细胞的 ATP 需求和质子漏的耗氧。代表细胞在基础状态下的能量需求。
（B）第一次加药——寡霉素（Oligomycin）：是一种抑制线粒体ATP合酶，即抑制呼吸链上的线粒体复合物V。该药可以影响或降低通过ETC的电子流。加入oligo之后OCR从基础呼吸降低的部分即为氧化磷酸化的耗氧率（ATP production）。
此时余下的部分则是质子渗漏造成的耗氧率。线粒体质子漏（Proton Leak）是指在线粒体内质膜上存在的一种通透性蛋白通道，允许质子从线粒体内腔返回细胞质，从而绕过线粒体ATP合酶（ATP synthase）。正常情况下，质子在线粒体内膜上形成质子梯度，通过ATP合酶驱动ADP和磷酸转化为ATP。然而，质子漏会导致质子梯度的损失，减少ATP的产生效率。
质子漏可以通过调节线粒体内膜上的蛋白通道来发生。一个重要的质子漏通道是线粒体内膜上的UCP（uncoupling protein）家族蛋白。UCP通道可以被激活，使质子通过线粒体内膜，而不经过ATP合酶。这样一来，质子梯度的能量将被释放为热量，而不是用于ATP合成。质子漏的发生可以增加线粒体呼吸过程中产生的热量，并影响细胞能量代谢和体温调节。
质子漏可作为线粒体损伤的标志，也可被认为是调节线粒体ATP合成的一种机制。
（C）第一次加药后下降——ATP合成（ATP production, ATP-linked respiration）：加入oligomycin后产生的耗氧下降部分，占基础呼吸耗氧的一部分，用于驱动ATP合成。代表线粒体满足细胞能量需求的ATP合成能力。
（D）第二次加药——FCCP：是一种线粒体解偶联剂，加入该药会破坏质子梯度和线粒体膜电位，引起电子在 ETC不受限制地传递，同时复合物Ⅳ的耗氧达到最大。FCCP 刺激的 OCR可被用来计算细胞备用呼吸能力（该值为最大呼吸与基础呼吸的差值），备用呼吸能力代表细胞对能量需求增加或在压力下作出反应的能力。
（E）第二次加药后上升——最大耗氧量（maximal respiration）：加入FCCP后获得的细胞最大耗氧。FCCP通过刺激细胞呼吸链以最大能力工作，来模拟一种生理上的“能量需求”，这引起了底物（糖、脂肪、氨基酸）的快速氧化以应对这种代谢挑战。代表了细胞能够实现的最大呼吸速率。
（F）第三次加药——鱼藤酮（rotenone）& 抗霉素A（antimycin A）：第三次加入的药物，是rotenone和antimycin A的混合物。Rotenone是复合物Ⅰ的抑制剂，antimycin A是复合物Ⅲ的抑制剂。这两种药物可关闭线粒体呼吸，从而能够计算出由线粒体之外活动所驱动的非线粒体呼吸耗氧。
（G）第三次加药后下降：①呼吸潜力（spare respiratory capacity）：最大呼吸减去基础呼吸的耗氧。代表细胞对能量需求的潜在响应能力以及细胞基础呼吸与理论呼吸最大值间的差距，细胞响应需求的能力可作为细胞适应性或灵活性的指标。②non-mitochondrial oxygen consumption： 加入rotenone和antimycin A后仍持续的耗氧，这是由一部分细胞酶继续耗氧产生的。该参数对于精确测量线粒体呼吸功能非常重要。
4.2 ECAR
（A）第一次加药——Glucose：实验第一次加入的药物是饱和浓度的葡萄糖，细胞通过糖酵解途径利用该葡萄糖并将其分解为 pyruvate，产生 ATP、NADH、水和质子。质子释放入胞外环境引起 ECAR 的迅速升高，这种由葡萄糖诱导的细胞应答被称为细胞在基础条件下的糖酵解能力。
（B）第一次加药后的上升——Glycolysis：葡萄糖转化为丙酮酸的过程，本实验中加入饱和浓度葡萄糖后细胞达到的 ECAR值，反映细胞在基础条件下的糖酵解能力。
（C）第二次加药——Oligomycin：实验第二次加入的药物为oligomycin，其为ATP合酶的抑制剂，可抑制线粒体ATP产生，从而将能量产生转移至糖酵解通路，引起 ECAR 进一步升高，反映了细胞最大的糖酵解能力。
（D）第二次加药后上升——酵解容量（Glycolytic capacity）：加入oligomycin后，细胞达到的最大ECAR值，指oligomycin有效关闭了氧化磷酸化功能后，迫使细胞利用糖酵解达到的最大产生能量的能力。
（E）第三次加药——2-DG（2-deoxy-glucose）：2-DG是最后加入的药物，该药通过竞争性结合糖酵解途径的己糖激酶而抑制糖酵解，引起ECAR降低从而证实实验中ECAR的产生来源于糖酵解途径。
（F）第三次加药后下降：①酵解储备（Glycolytic reserve）：Glycolytic capacity 与 Glycolysis的差值， 反映了细胞满足能量需求的能力，以及糖酵解功能与细胞理论最大值之间的接近程度。②Non-glycolytic acidification：细胞外酸化的其他来源，非来自糖酵解途径。
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