感染高危型人乳头瘤病毒(HPV)导致全世界5%的癌症，包括宫颈癌和口咽癌。HPV16占大多数，并且持续的角质形成细胞感染是主要的危险因素。病毒癌基因在人类致癌中的作用已经被深入研究了几十年，分化对病毒生命周期的重要性是已知的。病毒的生命周期依赖于复层鳞状上皮的分化程序，但支持病毒生命周期不同阶段的角质形成细胞亚群的格局尚未阐明。在2023年4月，发表在Nature Communications上的“Single cell transcriptomic analysis of HPV16-infected epithelium identifies a keratinocyte subpopulation implicated in cancer”一文（中文题目：HPV16感染上皮的单细胞转录分析确定与癌症有关的角质形成细胞亚群）中，研究者构建类器官并进行单细胞测序共识别出12个不同的角质形成细胞群，其中一个亚群被映射以重建它们在复层鳞状上皮中各自的三维位置。研究发现，与传统的终末分化细胞不同，HPV重新编程的角质形成细胞亚群(HIDDEN细胞)形成了表面区域，并需要ELF3/ESE-1转录因子的过度表达。
Visual summary
技术路线
研究内容
1. scRNAseq 揭示了 HPV16+ 与 HPV16− 复层鳞状上皮raft中不同角质形成细胞亚群的富集
研究者首先从HPV+ 和 HPV- 靠近形成皮肤的二倍体永生化角质形成细胞 (NIKS)构建了3D类器官raft，随后研究者对构建成功的HPV+ raft和 HPV- raft进行了单细胞测序，形成了12个角质形成细胞亚群(C0-C11)。其中C9 与其余 11 个簇唯一分离，并且在 HPV16+ 细胞中高度富集，3个簇 (C4、C5 和 C7) 富含 HPV16- 细胞，除 C9 外，C6 亚群也富含 HPV16+ rafts，而 C8 亚群只存在于 HPV16+ rafts中。
图1 HPV16+ raft与HPV16- raft的产生
图2 HPV16+ raft与HPV16- raft单细胞测序分群展示
2. 角质形成细胞亚群主要由分层鳞状上皮的分化程序来定义
研究者进行了拟时序分析发现，除了C9，其他所有角质形成细胞亚群都沿着鳞状上皮分化程序连续排列。依据基因表达特征，细胞亚群也显示出基底细胞（C10、C7、C6、C4 和 C5）或分化细胞特征（C1、C8、C0、C11、C2 和C3)。IHC 染色检查 HPV16- 和 HPV16+ raft中特异性标记物的蛋白质表达显示也与之前一致。然而，值得注意的是，HPV16+ 上皮细胞的分化标记物染色强度较低，表明 HPV 重编程抑制了正常的分化程序，特别是在上皮细胞的最上层。
图3 拟时序分析使细胞沿着三维分层上皮的分化程序排列
3. 基底上细胞簇的空间映射揭示了 HPV16+ raft中尚未描述的上皮区域
由于scRNA-seq不能识别空间位置信息，因此研究者使用 RNA-ISH来定位选定的角质形成细胞亚群。鉴于在基底上HPV+ vs HPV- raft中观察到的差异蛋白染色，最上面的分化亚群特别令人感兴趣。他们假设地理分布的差异可能反映了HPV 的转录重编程，并且也是图 3f 中观察到的蛋白质水平变化的基础。为此，C3被确定为最终末分化的细胞亚群。
之后研究者依据自己的筛选标准试图识别“聚类定义基因”，这些基因可以作为生物标志物，独立地表示聚类。他们确定了用于C2（C10orf99 和 DSG1）和C3（KLK7、SPRR1A、RDH12 和 POF1B）两个群中的基因。接下来，研究者发现终末分化的 C2 和 C3 角质形成细胞亚群在亚汇合单层培养物中基本上不存在，并且它们的形成需要上皮分化程序。RNA-ISH空间映射和C3生物标志物KLK7用于定位raft中的这种分化亚群。他们发现KLK7在 HPV+ 与 HPV- rafts 中的定位具有差异，表明HPV16+ rafts中基底上簇的失调。虽然KLK7+ C3细胞位于HPV16- rafts的最上层，但HPV16+ rafts在KLK7+细胞上方还有一个额外的区域（红标记线，图 4e）。
图4 分层鳞状上皮中终末分化的 KLK7+ C3 角质形成细胞亚群的空间定位
4. C9转录组定义了一个分化不协调的角质形成细胞亚群，该亚群形成了HPV16+raft的最上层
研究者识别并可视化了C9簇的生物标记物，包括ELF3、GPR110和Lcn2。相对于未分化（亚融合）细胞，C9 细胞标志物的表达在分化模型（过度融合细胞和raft）中增加。因此它仍然依赖于分化程序，研究者决定在复层上皮模型中进行研究。研究者用C9 簇标记物的 RNA-ISH 将这个群体定位到最上层的基底上区域，在 HPV16+ raft的许多细胞中具有强烈的染色。IF显示ELF3 和 LCN2 蛋白定位于 HPV16+ rafts 的最上层区域，而在 HPV16- rafts 中基本不存在。之后研究者应用通路分析和转录因子分析显示病毒发病机制和鳞状细胞分化的重要性。为了捕捉 C9 转录组的这些特征，他们将 C9 亚群称为 HPV 诱导的分化不协调上皮非常规 (HIDDEN) 细胞。
图5 C9细胞占据HPV16+上皮的浅表细胞层
5. HPV+宫颈raft中HIDDEN细胞上调
研究者使用了由原代宫颈角质形成细胞设计的器官型上皮raft（感染了HPV18的HPV+和HPV-）。通过 RNA-ISH和 IF检测到许多强烈染色的 ELF3+ 基底上细胞。这表明 (1) 在健康宫颈上皮细胞的基线观察到很少的 ELF3+ 细胞，(2) HIDDEN 细胞在宫颈上皮细胞中被 HPV 高度上调，以及 (3) 其他高危 HPV 类型如 HPV18 也诱导 HIDDEN细胞区域。
6. 在HPV驱动的宫颈癌发生的各个阶段都检测到HIDDEN细胞
研究者试图评估在宫颈上皮内瘤变(CIN)的不同阶段。一般来说，CIN1病灶包含病毒片段，而CIN2和CIN3含有片段和整合的病毒基因组，存在异常增生并发展为宫颈鳞状细胞癌（SCC）。研究者收集、处理和筛查疑似宫颈上皮内瘤变患者的宫颈活检组织中的高危HPV标志物p16。随后IF染色以寻找HIDDEN细胞生物标记物ELF3。结果显示：ELF3蛋白在正常宫颈外上皮组织中低表达或检测不到。但p16+基底细胞上方的组织显示出ELF3的强烈染色。这包括具有 HPV 特征和 CIN 病变的组织，无论等级如何。在具有 CIN 病变的组织的某些区域中，观察到 ELF3 染色在中间区域中更强烈，而在更浅表的细胞中染色强度较低（CIN1）。尽管如此，在所有 p16+ 组织中，HIDDEN 细胞都得到了极大的扩增。
图6 在HPV阳性宫颈raft和宫颈癌前病变中检测到HIDDEN细胞
7. HIDDEN细胞生物标志物在HPV+SCC肿瘤中升高
由于发现 HIDDEN 细胞持续存在于癌前宫颈组织 (CIN1-3) 的所有阶段，研究者提出 HIDDEN 细胞从癌前病变进一步持续存在到恶性鳞状细胞癌中。因此研究者分析了 PanCancer TCGA 以确定癌症中HIDDEN细胞生物标志物的表达。在可供分析的 488 名 HNSCC 患者中，与其余患者相比，9% 的 ELF3 表达显著升高 (z ≥ 2.0)。重要的是，该患者亚组在 HPV 状态、国际疾病分类 (ICD)-10 分类（指示解剖位置）、染色体 1q 异常和缺氧评分方面具有统计学显著差异。接下来研究者在HPV+ vs HPV- HNSCC 中探究了ELF3 的表达，也检测了按 ICD-10 分组的 HNSCC 中的 ELF3 mRNA 的水平。以上结果支持在 HPV+ 疾病过程（包括癌症）中存在 ELF3 驱动的分化鳞状细胞亚群。
随后研究者使用TCGA 数据集中的大型 HNSCC 和宫颈 SCC 患者队列改进 HIDDEN 细胞转录组，以识别强有力的共生生物标志物，用于检测 SCC 中的类似群体。
图7 ELF3 依赖性 C9 细胞群与 HPV+ 头颈和宫颈 SCC 相关
8. 在已发表的 HNSCC scRNAseq 数据中检测到 HPV+HIDDEN 细胞特征
为了在独立数据集中验证上述特征，研究者分析了9个 HPV- 和6个 HPV+HNSCC 肿瘤的已发表 scRNAseq 数据，并证实了 HIDDEN 细胞的存在且在HPV+中增加。
图8 在HPV+和HPV - HNSCC scRNAseq数据中检测到HIDDEN细胞
9. HIDDEN细胞在HPV+扁桃体raft和HPV+HNSCC患者活检组织中富集
研究者检查了HPV 感染和转化的头颈部组织中HIDDEN细胞是否存在。初级扁桃体上皮被用作口咽部 HPV 感染的模型。研究者通过检测HPV+和HPV -raft中 ELF3 和 GPR110发现 HPV+中HIDDEN 细胞显著上调。研究者也对 HNSCC 患者活组织进行了同样检查并具有同样发现。
图9 在 HPV+ 扁桃体衍生的上皮细胞和 HNSCC 患者活检组织中检测到HIDDEN细胞
10. ELF3 敲低抑制HPV16+上皮raft中的HIDDEN细胞
研究者在 HPV16+ NIKS 中敲低ELF3并用于生成raft。结果显示，ELF3 敲低几乎完全消除了 HPV+ raft最上层区域中的 ELF3+ HIDDEN 细胞，且HIDDEN 上皮亚群中与 ELF3 共表达的基因表达减少。这些数据表明，ELF3转录因子是分层 HPV16 感染上皮中基底上层HIDDEN细胞区室的形成和/或维持所必需的。
图10 HIDDEN 细胞区需要 ELF3 表达
主要结论
1. 报告了高危 HPV 感染的分层上皮细胞的转录组学景观；
2. 发现了形成隔室并有可能标记 HPV 感染组织表面的上皮HIDDEN细胞；
3. 鉴定了 ELF3作为 HIDDEN 区域所需的 HPV 诱导转录驱动因子；
4. 检测 HPV+ SCC 中的 HIDDEN 细胞富集并与预后不良相关联。
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