A NAC Transcription Factor Represses Putrescine Biosynthesis and Affects Drought Tolerance
这篇文章是2016年12月份发表在pp上的，关于枸橘中的一个与腐胺合成和干旱耐受相关的NAC转录抑制子。
1. 引言
大量证据表明，非生物胁迫会使植物积累各种不同的代谢产物——比如多胺类物质，来保护植物受到这些胁迫相关的损伤，从而来适应非生物胁迫。植物中有三种主要的多胺：腐胺、亚精胺和精胺。而本文主要研究的是腐胺。
Fig. 1
高等植物中，腐胺可由精氨酸经精氨酸脱羧酶催化而合成。腐胺的进一步积累，会使植物更好地适应非生物胁迫，比如本文中的干旱耐受。之前已经有很多研究报道了不同植物中ADC和腐胺在非生物胁迫中的功能，以及调控ADC的转录因子。但是，大部分报道的都是转录激活子，是正调控ADC和腐胺的合成。而本文发现的却是起负调控作用的转录抑制子，枸橘NAC72，这也可以说本文的一个创新点。
Fig. 2
2. 结果
然后我们来看一下，作者是如何展开实验工作的。
2.1 Yeast One-Hybrid-Based Screening and Sequence Analysis of PtrNAC72
之前工作已经报道了枸橘ADC基因的功能，于是作者通过酵母单杂技术，筛选到了位于ADC上游的转录因子，经序列分析发现是NAC家族的，且与拟南芥NAC072序列相似性最高，就将其命名为PtrNAC72，且发现N端在不同植物中高度保守，而C端则保守度低。
Fig. 3
Fig. 4
2.2 Expression of PtrNAC72 in Response to Different Stresses and ABA
接着以一个月大的枸橘幼苗为材料，用qRT PCR研究了该转录因子在响应冷胁迫、脱水胁迫和ABA时的相对表达水平，说明了确实是胁迫响应基因。
Fig. 5
2.3 PtrNAC72 Functions as a TF and �also a Transcriptional Repressor of PtADC
然后又以烟草为材料，瞬时表达35S-GFP空载和35S-PtrNAC-GFP融合载体，对该转录因子进行亚细胞定位，结果表明定位在细胞核。还进一步以酵母为材料，验证了转录因子的转录活性，且C端对转录活性很关键。
Fig. 6
作者进一步用酵母实验和EMSA证明了该转录因子不仅结合到ADC基因启动子区域，而且还是特异性结合到启动子CACG motif上。转录因子活性分为两种，转录激活和转录抑制，为了证明该NAC到底是转录激活子还是转录抑制子，作者又利用双荧光素酶分析和基于GAL4/UAS分析方法同时表明该转录因子是ADC基因的转录抑制子。
Fig. 7
2.4 PtrNAC72 Functions to Suppress Putrescine Biosynthesis
为了进一步了解该转录因子的功能，作者以过表达的转基因烟草28和1-1株系以及鉴定到的纯合的拟南芥nac72突变体和构建的回复株系为材料，进行转录因子功能研究，结果表明，该转录因子确实是负调控ADC表达和腐胺的合成。
Fig. 8
2.5 Drought Tolerance Assay Using PtrNAC72-Overexpressing�Plants and the nac72 Mutant
之前实验室的工作表明，ADC与干旱耐受相关，因此就猜想增加或者降低NAC72的表达丰度，可能会影响干旱响应。于是作者以超表达烟草株系和拟南芥突变体株系为材料，通过表型、存活率、电解质流失率、MDA含量、腐胺含量、水分流失速率等指标来表明对干旱的敏感还是耐受。结果显示，NAC72确实是在植物响应干旱胁迫方面起着负调控的作用。
Fig. 9
Fig. 10
Fig. 10
2.6 ROS Accumulation and Antioxidant Enzyme Activities under Drought Stress Conditions
因为ROS积累情况也是判断胁迫耐受程度的一个重要的指标，于是作者又通过DAB和NBT原位染色技术，分别检测了过表达烟草和拟南芥突变体中过氧化氢和超氧阴离子的含量，同时也测定了清除这两种ROS的抗氧化酶CAT和SOD的活性，结果表明，干旱胁迫条件下，NAC72在ROS积累，抗氧化物酶的活性方面，起到负调控的作用。
Fig. 11
2.7 Putrescine Levels Correlate with Drought Tolerance in PtrNAC72-Overexpressing Lines and nac72
实验数据表明，拟南芥突变体中腐胺含量明显高于野生型，而过表达烟草中腐胺含量低于野生型，加之腐胺也是参与胁迫耐受的，于是作者通过添加ADC抑制剂处理拟南芥和外源添加腐胺处理过表达烟草，并测定腐胺含量，观察表型，水分流失率，电解质流失率，MDA含量及ROS含量等指标，结果表明，腐胺含量确实与干旱耐受相关，且含量越高，越抗旱。
Fig. 12
Fig. 13
3. 讨论
经过一系列实验，作者最终确实是发现了了负调控ADC基因的转录因子，部分补充完善了ADC调控网络。但是这些发现的转录因子到底是独自调控ADC途径还是相互之间一起作用来调控仍然不清楚。此外，作者还发现，NAC家族成员能够识别的靶基因启动子序列的保守序列模体不仅只有CACG，还有很多其他保守基序，如GCTT等，这就可能跟NAC的Binding domain的氨基酸序列及空间结构有关，涉及到结构生物学问题，进一步研究可以深入了解NAC家族调控机制。最后，还有待解决的问题是，腐胺是通过什么机制来清除ROS的，是通过抗氧化酶吗，如果是，潜在的机制又是什么？仍然需要进一步阐明。
Fig. 14
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