2.2.2肌醇磷酸盐
GPCRs与Gq/11家族的G蛋白结合活化PLC，从而使位于质膜的磷脂PIP2水解为gi e IP3(也称为三磷酸肌醇；缩写为InsP3或IP3)和DAG。DAG继而激活PKC，而IP3作用于IP3受体，动员细胞内Ca2+。IP3的积累通常被用来衡量GPCR的功能。
基于alpha screen的测定方法与cAMP测定方法的原理相同(见方案2.1)；不同的是，在这种情况下，细胞IP3与生物素化的IP3竞争，酶标仪读数随着IP3的数量增加而降低。迄今为止，最常用和最可靠的测量IP3积累的方法依赖于检测掺入膜磷脂的3H肌醇。因此，如果研究的激动剂受体系统结合并激活PLCs，激动剂的刺激将导致质膜中3H肌醇磷脂的水解，形成3H肌醇磷酸盐(3H-IP)。3H-IP从3H肌醇中分离出来，液体闪烁计数可用于样品中3H-IP的定量。阴离子交换层析法是分离3H肌醇和3H-IP最常用的方法。这一过程耗时、费力，会产生大量的放射性废物。基于过滤的半自动阴离子交换色谱法应运而生，适用于96 ~ 384孔板格式。近来, 闪烁接近实验 (SPA) 技术应用于固定化金属离子或硅酸钇的亲和色谱法，可以在 96 - 384 孔 板中分离3 H-IP。金属离子(或硅酸钇)的正电荷与带负电荷的3H-IP结合，促进了3H-IP与中性的3H肌醇的分离。使用β-counter可以量化96/384孔板的放射性；例如,Topcount。由于使用了放射性标记的肌醇，因此，在选择分析格式时，放射性废物的处理是一个重要的考虑因素。其他重要的考虑因素是设备的易得性、所需的通量水平和成本。
2.2.3细胞内钙离子
钙离子可能是最广泛的被检测的细胞内信使。针对许多不同的信号，胞质内Ca2 +的浓度上升会触发各种不同的事件，如肌肉收缩，神经突触释放神经递质，分泌荷尔蒙，T细胞和B细胞活化，细胞凋亡以及各种由PKC介导的生化变化。GPCRs可以通过IP3与内质网(ER)表面IP3受体的结合，触发内质网Ca2+的释放。偶联Gq引起的GPCRs激活会激活PLCβ酶。PLC-β是PIP2代谢途径中的关键酶，可以将PIP2水解成两个第二信使：IP3和DAG。
有许多市售的钙检测试剂盒，在计划实验时应该考虑几个因素：要评估的钙浓度范围、可用的仪器和染料的负载。
1 Fura-2是一个紫外线激发的Ca2+指标。结合Ca2+后，Fura-2显示出吸收位移，通过扫描300到400 nm之间的激发光谱同时监测在∼510 nm处的发射可以观察到。Ca2+比率测量提供了一个非常强大的检测系统，因为它们不受染色负荷、漂白或光照强度的影响。然而，检测需要一个含有紫外线光源的酶标仪；例如，FLIPR(MD)。
2 .可见光激发的Ca2+指标比紫外线激发的指标有几个优势。一个主要的优点是利用大多数基于激光的台式酶标仪可以实现有效的激发。样品自身荧光的干扰也减少了，细胞的光损伤和光散射也减少了。然而，缺点是荧光强度取决于几个与钙浓度无关的因素，如获取条件和探针浓度。基于这一类型的两个主要指示剂是Fluo-3和Fluo-4。Fluo-4是Fluo-3的类似物，后者的两个氯取代基被氟原子取代。Fluo-4在488 nm处有增强的荧光激发，因此，在微孔板筛选应用中，Fluo-4的信号水平增加了一倍多。Fura-2、Fluo-3和Fluo-4可作为细胞渗透盐用于微注射实验或作为乙氧基甲基(AM)酯，可被动地扩散穿过细胞膜；一旦进入细胞，这些酯被细胞内酯酶裂解，产生细胞渗透荧光指标。AM酯用于微孔板分析格式，适用于需要机器人和微型化的高通量分析。
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