科学问题：
破译乳腺癌远期转移患者中参与病理剪辑的RNA结构密码
亮点：
发现之前未知的结构剪切增强子，在高转移细胞的增加的盒式外显子附近富集（exons with increased inclusion）。剪接体蛋白-小核核酸蛋白多胎A--SNRPA与这些结构剪切增强子联系来促进盒式外显子增加。这种交互作用促进转移性肺定值和癌细胞侵袭，部分由SNRPA1介导调节的PLEC选择性剪切，这个调控作用可以被间接调控剂吗啉抵消。证实了SNRPA1作为促转移剪接增强子的非标准调节作用
结构剪切增强子--structure splicing enhancer-SSE
background and introduction
①选择性剪接是转录后调控机制，对转录组和蛋白质组的多样性至关重要。
②AS的失调作为乳腺癌远处转移的驱动因素
③驱动异常RNA剪接程序的潜在调控途径及其主要因素和反式调节因子尚不清楚。在这个过程中特别感兴趣的是RNA二级结构编码的调控信息的作用，它控制着splicing的决定
④SNRPA1 is a component of the U2 small nuclear ribonucleoprotein (snRNP), which recognizes the branchpoint site in the initial steps of pre-mRNA splicing。
S3E(SNRPA1-associated structural splicing en-hancer).
⑤what is cassette exon inclusion：
A regulated excon that is sometimes included and sometimes excluded from the mRNA is called cassete exon。
结果：
1、影响选择性剪接的RNA结构元件
①对三阴乳癌细胞系及衍生的肺转移细胞系进行RNA测序
②使用MISO来识别差异剪接的盒外显子，在high metastatic cell 和 poorly metastatic cells之间。细胞肺转移能力的增加伴随着细胞系广泛的AS景观调节。
③作者开发了一款工具--TEISER 来使用RNA structure 和序列信息来识别顺式调控元件。使用pyTEISER发现一个以前未知的，高度特异的RNA结构元件，被富集在盒外显子或其相邻内含子的250个核苷酸中。
④MAD-LM2中明显高内含子的外显子中，23.2%的外显子出现过SSE，而其他所有外显子中有5.8%的外显子出现过SSE。这些SSE富含GC（76.5%）
⑤乳腺癌患者异种源性异种种植（PDX）模型的PDX模型，HCI-002 (poorly meta-static) and HCI-001 and HCI-010 (both highlymetastatic）分析RNA-seq数据，随着转移能力增加，SSE的外显子明显增加
⑥我们用一个由三个串联SSE元件组成的SSE模拟RNA寡核苷酸转导入乳腺癌细胞，预期的功能是作为内源性SSE因子的突变体，从而抑制这些因子的功能，相比于对照组，skip exon varient PSI的值显著减少。
这个结果表明SSE可以影响宿主转录本的可变剪辑。
2、SNRPA1与一个结构特异性增强子相互作用以控制选择性剪接
①使用质谱法进行RNA共沉淀，以鉴定与SSE相互作用并调控SSE的蛋白。
作者用MDA-LM2高转移性乳腺癌细胞的全细胞裂解液孵育SSE模拟态RNA或对照RNA，并用质谱法鉴定与这些RNA共沉淀的蛋白质。该分析确定SNRPA1（小核核糖核蛋白多肽A′）是与对照RNA下拉相比在SSE中富集最多的RNA结合蛋白（图S1G）
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②SNRPA1是U2小核透明核糖核蛋白（snRNP）的一个组成部分，它在前体mRNA剪接的初始步骤（36–38）中重新识别分支点位点
③与MDA亲本细胞与MDA-LM2细胞中观察到的剪接差异一致，我们观察到MDA-LM2细胞中的SNRPA1 mRNA和蛋白质水平显著高于MDA亲本细胞（图1C和图S1H）。这种增加是由于SNRPA1而不是其他U2 snRNPcomponents引起的（图S1、I和J）
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④为了检测SNRPA1是否影响含S3E外显子的表达，我们使用小干扰RNA（siRNAs）在MDA-LM2细胞中敲除SNRPA1，然后进行RNA序列分析。我们观察到显著的富集，与对照细胞相比，S3Es在外显子（和侧翼内含子序列）中的表达减少（图1D）
在含有S3E的MDA-LM2细胞中，大量表达的外显子在SNRPA1沉默后PSI显著降低（比值比=2.4，P<3×10）−27，费希尔试验）。相反，在MDA亲本细胞中SNRPA1过表达后，我们发现外显子（和侧翼电子序列）中S3Es的含量显著增加，且显著增加（优势比=3.1，P<2×10）−11，Fisher'sexact检验）和PSI增加与S3E发生之间的总体显著相关（P<3×10）−16，logistic回归分析；图1E）
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⑤对MDA-LM2细胞中的SNRPA1进行clip-seq--交联和免疫沉淀测序观察到SNRPA1和RNU2有强有力的相互作用（Fig2.A）;使用clipper和CTK（clip tool kit）计算得到S3E均明显富集（FIG2.B S2.AB）
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⑥clip结果显示MDA-LM2的SNRPA1的结合位点处盒式外显子保留增加，相较于MDA-poarental cell。（fig.2C）同时SNRPA1 敲降后，盒式外显子保留减少，相较于对照组(fig.2D)。这些结果可在用于差异剪接定量的多种统计方法重现（S2C）
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⑦考虑到紫外线交联的短距离要求(41)，SNRPA1 CLIP-seq捕获的非RNU2结合位点有望来源于SNRPA1与核心剪接体外这些位点的直接结合。为了支持这一点，我们检测到SNRPA1结合位点和实验注释的人类分支点位点(3000个SNRPA1结合位点中的3个)之间非常有限的重叠
⑧SF3B1是另一种U2 snRNP的组成成分，能够结合RNU2。SF3B1的clip-seq数据显示 ，虽然，像SNRPA1一样，大多数SF3B1结合位点出现在内含子中(图S2D)，但我们观察到只有1 %的重合，在SF3B1和SNRPA1结合位点(图S2E)。此外，我们没有发现由SF3B1或SNRPA1结合的注释的选择性剪接外显子的实质重叠(8%重叠；图S2F)。此外，在SF3B1结合的外显子和侧翼内含子序列中，我们检测到SNRPA1缺陷或过表达细胞的选择性剪接事件与对照细胞相比没有显著变化
⑨为了支持我们的假设，即SNRPA1在AS中具有与U2 snRNP无关的作用，我们试图确定U2 snRNP组分的化学计量。我们对MDA-亲代全细胞裂解物进行了质谱分析，结果表明SNRPA1是U2 snRNP复合物中含量最丰富的亚单位，与其他U2 snRNP成分相比，平均存在至少三倍的摩尔过量(图S2G)。总之，这些结果表明SNRPA1可能在剪接体外作为选择性剪接的调节因子
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⑩我们还通过敲除额外的剪接体成分，对MDA-LM2细胞进行RNA-seq操作，测试了SNRPA1结合具有SNRPA1依赖性AS变化的外显子的特异性。为此，我们测试了SNRPB2 (U2 snRNP BW)，它与SNRPA1 (40)一起结合U2 RNA发夹IV，以及更一般的剪接体因子SNRPB(SmB/B’)，这是Sm复合物的一部分，存在于除U6以外的所有剪接体snRNP中
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（11）我们没有发现SNRPB2或SNRPB敲除诱导的AS事件附近外显子上SNRPA1结合位点的显著富集(图S2H)，表明SNRPA1介导的含S3E外显子的调节不依赖于其剪接体控制
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(12)总之，这些数据表明S3Es (i)调节乳腺癌细胞中转录物子集的AS，(ii)与SNRPA1结合，以及(iii)通过与SNRPA1的直接相互作用影响选择性剪接。
3、SNRPA1促进侵袭和体内转移定殖
①由于SNRPA1控制转移性乳腺癌细胞中的选择性剪接模式，我们用体内实验转移试验测试了SNRPA1是否影响乳腺癌进展。我们向NOD scid gamma (NSG)小鼠的静脉循环中注射了MDA-LM2细胞和短发夹RNA(shRNA)–介导的SNRPA1敲除，随后进行生物发光成像以测量肺转移定殖随时间的变化。与表达对照shRNA的细胞相比，SNRPA1缺失细胞的转移能力降低了9倍P = 0.04，双向方差分析(ANOVA)。
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②类似地，当使用毒瘤乳腺癌细胞系，HCC1806-LM2 进行转移性肺定殖分析时，我们发现SNRPA1敲除细胞与本背景下的对照细胞相比，转移定殖能力降低(6倍，P = 0.04，双向方差分析)(图3B)。
③SNRPA1敲除并未导致植入小鼠乳腺脂肪垫的细胞肿瘤生长显著减少，提示SNRPA1并未显著影响原发性肿瘤生长(图S3A)。此外，我们观察到SNRPA1敲除后，这些细胞系的体外增殖率没有显著差异(图S3B)。
检验方法
1、hypergeometric test--超几何检验
2、two-way analysis of var-iance (ANOVA)--双因素方差分析
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