请教高手我的样品如何去盐更好：低丰度血浆样品，蛋白量约300ug,体积约60ul,因含盐浓度高达160mM，而我的下游分析要求去盐。如用超滤方法有矛盾，过大稀释可能使盐浓度很低，但会造成蛋白损失越大，过小稀释又怕去盐不好。过液相柱又怕蛋白损失，不知还有什么好办法既去盐效果佳蛋白损失又达最小？
将25微克某重组蛋白(最小多聚体分子量>65kD）溶于0.5毫升PBS，过凝胶层析柱，收集液ELISA测定浓度后全部收集约10毫升，Millipore的30kD超滤管回收，浓缩至1毫升，再次ELISA测定，没有了。我个人认为是吸附在膜上了。书上说，截留分子量高的膜吸附较高，但没有具体数值，损失惨重，两千块的重组蛋白，一下子就消失了
感谢pumc506奉献自己宝贵的经验，截留分子量高的超滤管蛋白损失如此大让人触目惊心，但不知您用多少离心力，要提高回收率有一做法是把离心力设在最大离心力的一半。我最近的实验：低丰度血浆蛋白，蛋白量约300ug,体积60ul,但因其缓冲液中含有：
8 M urea, 2% CHAPS，5% acetic acid，150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4.想去掉这些物质，并想最好把缓冲液替代为0.5M的TEAB.
我预实验用3K的millipore超滤管，7000g，分别以1：4和1：7-8的0.5M的TEAB超滤替代，最后蛋白的回收率分别为75%和65%，当然特别耗时。但因每次加1：4的0.5M的TEAB超滤时并没有超滤浓缩至60ul（怕蛋白损失过大）,所以如8 M urea最后的浓度也不能以1/5的4次方相乘算，进一步想，就算每次浓缩回至60ul，且蛋白损失也可在接受范围，也不敢保证上面所列要去除的物质基本去除。
故考虑以下手段不知哪个可选择：
1.Zeba™ Desalt Spin Columns，先去盐，其他几种物质是否能去？
2.mini dialysis unit 1K,200ul，先去盐，若不能去掉其他几种物质再超滤。
3.Bio-Rad的Micro Bio-spin column去盐。
4.Cleanup 疏水固相萃取柱，捕获蛋白，再用0.5M的TEAB去溶。
希望园里的高手帮忙啊！
网友评论