对于多细胞生物而言，细胞存在固有的异质性。随着单细胞测序技术的迅速发展，极大地丰富了我们对于细胞异质性和细胞功能的理解。近年来，随着植物原生质体制备等难题的逐步突破，植物单细胞测序愈发火爆，仅2021年上半年就已发文十几篇，其中不乏Cell、Nature Communications等期刊，广泛应用于拟南芥、水稻、玉米、番茄、杨树等物种。因此，植物单细胞测序的应用潜力不言而喻。那植物单细胞测序到底能如何大展身手呢？
一、构建细胞图谱
植物组织是由不同形态且具有特定功能的细胞构成，不同细胞类型，其基因表达模式也存在差异。通过单细胞转录组测序，构建植物细胞图谱，使我们能深入了解植物组织中细胞类型的组成，获取每个细胞独特的转录本信息，从而鉴别细胞身份和功能。例如，2021年4月，中国科学院分子植物科学卓越创新中心的研究人员在期刊Nature Communications上发表的文章中，以5日龄野生型水稻（ZH11）幼苗胚根（靠近根尖1cm，约90个幼苗）为材料制备原生质体进行单细胞转录组测序。以获得的27,469个高质量单细胞转录组数据构建了水稻胚根细胞图谱，通过细胞聚类及注释分析，利用UMAP可视化，将这些细胞划分为21个不同的细胞类群，涵盖水稻根表皮、外皮层、厚壁组织、皮层、内皮层、中柱鞘、分生组织、维管组织等细胞类群。由此表明，水稻根尖是由高度异质的细胞组成的。
图1 水稻胚根细胞图谱（图片引自文献[1]）
二、鉴定稀有细胞类群
基于液滴法的高通量单细胞测序使得捕获植物发育过程中各个时段的细胞成为可能，因此，通过绘制植物单细胞转录图谱，不仅可以鉴定植物组织中的主要细胞类型，还可以鉴定出植物组织中稀有的细胞类群。通过稀有细胞类群的鉴定，有利于深入挖掘其在植物发育分化过程行使的重要功能。例如，2019年2月，德国图宾根大学的研究人员在国际学术期刊Developmental Cell上发表的文章中，以6日龄拟南芥幼苗根尖（距离根尖1cm）为材料进行了单细胞转录组测序，通过特异性QC（静止中心）Marker基因鉴定出拟南芥根组织中稀有细胞群体QC细胞，并且发现，在亚簇C11.1中36个细胞至少表达了一半的QC基因，这与单细胞测序的采样深度以及大部分QC基因的相对低表达相一致。通过QC细胞和分生组织未分化细胞进行转录组比较，确定了254个优先在QC中表达的基因。QC细胞的鉴定，为深入研究这一罕见细胞类型的生物学功能提供了更多可能。
图2 拟南芥根分生组织静止中心细胞Marker基因鉴定（图片引自文献[2]）
三、挖掘新Marker基因
在多细胞生物中，细胞类型以及细胞特异性功能的产生在很大程度上源于细胞中不同基因的差异表达。在单细胞转录组数据分析过程中，主要通过差异分析鉴定出某个细胞亚群的特征性基因，再结合Marker基因鉴定细胞类型。因此，新Marker基因的挖掘有助于深入阐明细胞异质性, 并且对于识别植物发育过程中未知细胞类型的细胞群体是非常关键的。例如，2020年6月，河南大学的研究人员在Molecular Plant期刊上发表的文章中，以5日龄拟南芥幼苗子叶为材料进行了单细胞转录组测序，利用几个已知的参与调控气孔谱系细胞发育的Marker基因对鉴定的细胞类型进行验证，发现FAMA、TMM、HIC和SCRM在特定细胞类型中特异性表达，而其他标记基因在特定的细胞类型中没有特异性表达，因此，为了探究气孔谱系细胞发育的潜在调控因子，分析了不同细胞类群中的基因表达谱，在每个细胞群中鉴定了高表达的标记基因即新Marker基因，并且进一步发现，这些Marker基因中部分可能参与调控气孔谱系细胞的发育。
图3 每个细胞簇新Marker基因的鉴定（图片引自文献[3]）
四、研究细胞发育动态
拟时序分析是指根据细胞之间表达模式的相似性对单细胞沿着轨迹进行排序，以此推断出发育过程中细胞的分化轨迹或细胞亚型的演化过程。通过绘制植物细胞间的发育分化轨迹来重塑细胞随着时间的变化过程，可以深入挖掘随着细胞状态的变化其细胞类型的改变，并进一步解析植物细胞分化路径，了解植物细胞的动态发育过程。例如，2021年4月，中国科学院分子植物科学卓越创新中心的研究人员在Nature Communications国际学术期刊上发表的文章中，以5日龄水稻胚根（距离根尖1cm，n=90）为材料制备原生质体进行单细胞测序，在该研究中，研究人员不仅揭示了水稻根单细胞异质性，还重建了水稻根表皮细胞（epidermal cell）和地上组织（ground tissue）细胞的连续发育分化轨迹，明确了在根尖干细胞分化过程中基因表达与基因染色质可及性的相关性，同时，结合拟南芥根尖和水稻根尖的转录组图谱和标记基因分析，揭示了单子叶植物水稻和双子叶植物拟南芥在根尖细胞类型上的进化保守性。
图4 水稻胚根表皮细胞的分化轨迹（图片引自文献[1]）
五、基因调控网络分析
组织内细胞异质性的基础是细胞转录状态的差异，转录状态的特异性又是由转录因子主导的基因调控网络决定并维持稳定的。对于植物发育的调控机制研究，从不同细胞类型的转录因子调控网络开始分析，有助于深入理解细胞发育的生物学功能。例如，2020年6月，河南大学的研究人员在Molecular Plant期刊上发表文章中，对来自5日龄拟南芥幼苗子叶中的12,844个单细胞进行了RNA测序，成功构建了拟南芥气孔谱系细胞的基因表达谱。在该研究中，研究人员为了发现参与调节气孔谱系细胞早期发育的潜在转录因子，对不同细胞类型中高表达的转录因子进行了研究，通过构建转录调控网络，揭示了从拟分生组织母细胞（MMCs）到保卫母细胞（GMCs）这一特定气孔发育阶段中转录因子的调控网络，研究结果表明TML1、BPC1、BPC6、SCRM、PIF5和WRKY33可能是调控MMCs、EMs、LMs和GMCs靶基因表达的核心转录因子。
图5 不同细胞类型转录因子调控网络的鉴定（图片引自文献[3]）
六、非生物胁迫响应机制研究
非生物胁迫属于植物生长发育过程中的重要环境影响因素。通过单细胞转录组测序，探索不同处理条件下植物组织中细胞类型的组成变化，从而解析非生物胁迫反应机制，有利于我们了解单细胞水平上植物细胞和发育生物学的机理。例如，2020年9月，比利时根特大学的研究人员在Science国际顶级期刊上发表的文章中，以6日龄拟南芥幼苗根尖为材料制备原生质体进行单细胞转录组测序，探索低磷酸盐条件下拟南芥根应对该非生物胁迫的响应机制。研究表明，TMO5/LHW靶基因响应显著富集在根毛细胞中。在低磷条件下，TMO5/LHW异源二聚体会诱导维管细胞中可移动细胞分裂素的合成，从而通过改变表皮细胞的长度和细胞命运来增加根毛的密度。其次，缺乏磷酸盐所导致的根毛响应依赖于TMO5和细胞分裂素。该研究揭示了细胞分裂素信号转导将表皮上根毛响应与维管细胞对磷酸盐缺乏的感知联系到了一起。
图6 TMO5活性是根毛响应低磷条件所必需的（图片引自文献[4]）
七、保守性及差异性分析
针对植物同一物种不同亚种间或不同物种间外观形态、生物学性状特征等方面作比较，在种质资源研究中具有重要意义。基于单细胞水平，绘制同一物种不同亚种间的单细胞转录组图谱，通过不同亚种之间的比较，不仅可以揭示不同亚种在发育过程中分化轨迹的差异性和保守性，且有助于深入解析不同亚种在应对外部环境刺激的响应机制。例如，2020年12月，中国农业科学院生物技术研究所的研究人员发表在Molecular Plant上的文章中，以两个重要水稻栽培亚种（Nip和93-11）的3日龄幼苗根尖为材料进行了单细胞转录组测序，分别构建了这两个水稻亚种根尖的转录组图谱，通过拟时序分析发现，水稻根尖表皮的分化是以表皮细胞为起点，沿着假时间主干，一端最终发育为成熟的表皮细胞，一端最终分化为根毛细胞，两个水稻亚种的发育轨迹显示高度一致的拟时间顺序，揭示了不同亚种之间发育轨迹的保守性。功能富集分析发现，两个水稻亚种每种细胞类型的差异表达基因中大多数基因与环境响应有关，而且不同水稻亚种在受到外部环境刺激时响应机制存在差异。
图7 粳稻Nip和籼稻93-11的细胞类型存在高度保守性（图片引自文献[5]）
八、重要转录因子功能研究
在植物单细胞测序中，不仅可以基于构建的基因网络鉴定在植物发育分化过程中起着关键作用的核心转录因子，还可以针对已知功能的转录因子进行突变体研究，从而解析该转录因子功能的丧失对植物组织成分以及细胞特性和分化的影响，有助于进一步探究重要转录因子是如何参与植物的组织或器官发育的。例如，在根中，SHORTROOT（SHR）和SCARECROW（SCR）这两个转录调控因子在转录调控复合体中发挥重要作用，而且对干细胞龛的维持和组织模式至关重要。在2020年6月，美国杜克大学的研究人员在bioRxiv发表的文章中，就以这两个转录因子的突变体为材料进行了单细胞转录组测序，绘制了拟南芥shr-2和scr-4突变体细胞图谱，以野生型拟南芥（WT）为对照，探究了SHR或SCR功能的缺失对于组织组成以及细胞的身份和分化的影响，结果发现，相比于WT，shr-2突变体中木质部、韧皮部和中柱鞘细胞的丰度显著减少，在scr-4中也检测到类似的变化，与已报道结果一致。
图8 拟南芥shr-2 和scr-4突变体细胞图谱揭示细胞类型及特性变化（图片引自文献[6]）
九、总结与展望
多篇植物单细胞转录组测序文章的发表证实了高通量scRNA-seq 方法在植物研究中的可行性和有效性，预示着植物研究已然进入了单细胞时代。在植物中开展单细胞转录组研究有助于深入理解不同细胞类型在发育过程中的作用以及细胞间的调控网络。但植物单细胞测序的应用方向远不止于此，从单一组织到多组织，单细胞多组学联合分析等亦是趋势。我们相信，在未来，植物单细胞测序遍地开花，时日可待。
参考文献：
[1] Zhang T Q, Chen Y, Liu Y, et al. Single-Cell Transcriptome Atlas and Chromatin Accessibility Landscape Reveal Differentiation Trajectories in the Rice Root[J]. Nature Communications, 2021.
[2] Denyer T, Ma X, K Lesen S, et al. Spatiotemporal Developmental Trajectories in the Arabidopsis Root Revealed Using High-Throughput Single Cell RNA Sequencing[J]. Developmental Cell, 2019.
[3] Liu Z, Zhou Y, Guo J, et al. Global Dynamic Molecular Profiles of Stomatal Lineage Cell Development by Single-Cell RNA Sequencing[J]. Molecular Plant, 2020.
[4] Wendrich J R, Yang B J, Vandamme N, et al. Vascular Transcription Factors Guide Plant Epidermal Responses to Limiting Phosphate Conditions[J]. Science, 2020, 370(6518).
[5] Liu Q, Liang Z, D Feng, et al. Transcriptional Landscape of Rice Roots at the Single Cell Resolution [J]. Molecular Plant, 2020.
[6] Shahan R, Hsu C W, Nolan T M, et al. A Single Cell Arabidopsis Root Atlas Reveals Developmental Trajectories in Wild Type and Cell Identity Mutants. bioRxiv, 2020.
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