immunohistochemistry

1. 配PBS： NACL 45g， NA2HPO4(2H2O):30g，NAH2PO4(2H2O):2g
   加ddH2O至5L
2. 开风机，预实验标本二甲苯脱蜡：二甲苯I 30min，二甲苯II 30min，二甲苯III 30min
3. 水化：100%乙醇20min，100%乙醇20min，100%乙醇20min，90%乙醇20min，80%乙醇20min.
4. 清洗： PBS 3min 洗3次. 可准备两个放标本的盒子
5. 配抗原修复液： 一水合柠檬酸 0.2g（柠檬酸）二水合柠檬酸 1.5g（柠檬酸） ddH2O：500ml
   倒入杯里，用手套套在杯上，橡皮筋
6. 抗原修复液修复抗原：用手套封闭好，扎孔，放入微波炉中，？
   修复时间：①高火：6min，4次
   ②100%火力， 4min微波至沸腾，开门冷却5min（P100微波）
   40%火力，10min
   @100%火力 6min， 停 3min
   100%火力 3min， 停 3min
   100%火力 3min， 停 3min
   100%火力 2min， 停 2min
   降温1-2h
7. 清洗：PBS 3min ，洗3次
8. 加试剂盒（通用的）A液1-2滴或50ul，滴在盖玻片上, 放入37°恒温箱30min
9. PBS: 5min, 洗3次
10. 加试剂盒（通用的）B液1-2滴或50ul，滴在盖玻片上, 放入37°恒温箱20min。 B液不能洗！！！！！
11. 一抗，浓度可调【PBS代替一抗，作为阴性对照，作一张】 把一抗滴在组织上面，要盖过组织的边缘
12. 4°过夜14-16h 里面放用自来水润湿的纱布！
13. 复温：室温 40min或37° 3min 前面的步骤一定要保持湿润！
14. PBS： 3min，洗3次
15. 二抗（即C液）每个片子加1滴：37° 恒温箱30min
16. PBS：3min，洗3次
17. D液：：37°*30min
18. 配制DAB（用 避光EP管）：850ul ddH2O +1滴A +1滴B+1滴C，4°恒温保存
19. PBS：3min，洗3次
20. 关灯，10倍镜下显微镜观察至棕色。 加DAB 70－100ul，显色4－6min后放入ddH2O终止显色. 片子一起观察完，放到小盒里～
    21. 苏木素 原液 复染 2min
    22. 返蓝 自来水冲洗5min
    23. 脱水：75%乙醇10min，90%乙醇10min，100%乙醇10min，100%乙醇10min，100%乙醇10min，
        二甲苯I 10min，二甲苯II 10min
    24. 封片风干： 干性树胶 滴一下
    25. 显微镜下观察

抗体用PBS稀释
每个白片65ul左右，70足矣