1 摘要
Antibody-drug conjugate(ADC) 通常由 mAbs 通过化学连接子与细胞毒性药物共价连接而成。它兼具高度特异性的靶向能力和强大的杀伤作用，可实现对癌细胞的精准高效清除，已成为抗癌药物研发的热点之一。自 2000 年 FDA 批准首个 ADC Mylotarg 以来，全球迄今已有14个 ADC 获得上市批准。此外，目前已有100多个ADC候选药物进入临床阶段。本文章对 ADC 的历史和一般作用机制进行了回顾，然后简要讨论了 ADC 关键组成以及这些组成影响ADC活性的机制。此外，文章还回顾了已批准的 ADC 和其他处于 3 期临床试验的有希望的候选药物，并讨论了下一代药物开发的当前挑战和未来前景，为使用 ADC 研发新型癌症治疗方法提供了见解。
2 ADC的发展
1、以细胞毒性药物为基础的化疗一直是治疗癌症的主要方法。细胞毒性药物包括 DNA 碱基类似物（5-氟尿嘧啶和 8-氮鸟嘌呤）、DNA 相互作用剂（顺铂和放线菌素 D）、抗代谢物（氨基蝶呤和甲氨蝶呤）和微管蛋白抑制剂（紫杉醇和长春新碱衍生物）等。大多数化疗药物具有严重的副作用，这主要由于其非特异性的暴露于脱靶组织
2、mAb 的出现改变了癌症治疗的模式，它能精确靶向肿瘤表面抗原，然而 mAb对癌细胞的杀伤力不如化疗。ADC 是由一种肿瘤靶向 mAb 通过精心设计的化学连接子与细胞毒性的 payload 偶联而成。它可以弥补 mAb 和细胞毒性药物之间的差距，改善治疗效果
3、Fig1 显示了 ADC 从初期到成熟发展期百年来的里程碑事件。
3 ADC的关键组成
1、如图Fig2 所示，ADC 由抗体、细胞毒性载荷和化学连接子组成。理想的 ADC 药物应在血液循环中保持稳定，准确到达治疗靶点，并最终在靶点（例如癌细胞）附近释放细胞毒性有效载荷。每个元素都会影响 ADC 的最终疗效和安全性，一般来说，ADC 开发需要考虑所有这些关键要素，包括 靶抗原、抗体、细胞毒性有效载荷、接头或者连接子的选择以及偶联方法
3.1 靶抗原的选择
1、肿瘤细胞上表达的靶抗原是 ADC 药物识别肿瘤细胞的导航方向，也决定了将细胞毒性有效载荷递送到癌细胞的机制（例如内吞作用）。因此，选择合适的靶抗原是ADC设计的首要考虑因素
2、靶抗原需要满足以下要求：（1）为了降低脱靶毒性，靶抗原首先应该专门或主要在肿瘤细胞中表达，而在正常组织中表达较少或较低；（2）抗原是表面（或细胞外）抗原，而不是细胞内抗原，以便被循环 ADC 识别，例如 HER2 受体。此外，靶抗原应为非分泌型，因为循环中的分泌型抗原会导致 ADC 不良地结合到非肿瘤部位，从而导致肿瘤靶向性降低和安全性问题增加（3）靶抗原最好在与相应抗体结合后被内吞，这样 ADC-抗原复合物就能进入癌细胞，然后通过适当的细胞内运输途径并迅速释放细胞毒性有效载荷
3、如图Fig3所示，已获批ADC药物的靶抗原一般都是癌细胞中过表达的特异性蛋白，包括实体瘤中的HER2、TROP2、nectin4 和 EGFR，以及血液系统恶性肿瘤中的CD19、CD22、CD33、CD30、BCMA和CD79b
4、在肿瘤学和免疫学基础研究的推动下，ADC 的靶抗原的逐渐从传统肿瘤细胞抗原扩展到肿瘤微环境中的靶点，例如基质和血管系统。新生血管系统、内皮下细胞外基质和肿瘤基质的成分可能是 ADC 药物开发的有价值的靶抗原。例如，基质靶向ADC药物有可能通过降低基质驻留细胞产生的生长因子浓度来导致癌细胞死亡。由于癌细胞的存活取决于血管生成和基质因素，ADC 可能通过靶向此类组织而具有更广泛的功效。此外，这些细胞的基因组比癌细胞的基因组更稳定，这可能提供一种有希望的方法来降低突变诱导耐药性的可能性
3.2 抗体部分
1、理想的靶向肿瘤抗体需要具有较高的亲和力、有利于内吞、较低的免疫原性和较长的血浆半衰期
2、IgG1是 ADC 常用的亚型，因为IgG1在血清中含量最丰富，并且能够通过与Fc受体的高结合亲和力诱导强效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、抗体依赖性吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒作用（CDC）
3、抗体-抗原复合物的内吞效率主要取决于抗体与肿瘤细胞表面抗原的结合亲和力，亲和力越高，内吞速度越快。 但是，抗原亲和力过高反过来可能会降低实体瘤的渗透性，导致 ADC 被困在血管附近，远离血管的肿瘤细胞渗透性差。因此，应优化抗原与抗体之间的亲和力，以平衡靶细胞的快速吸收和抗癌效力。
4、除了结合亲和力外，影响肿瘤渗透的另一个因素是抗体的大小。为了让ADC更好地应用于实体瘤治疗，研究人员尝试通过去除FC片段，将抗体微型化
3.3 连接子
1、ADC 中的连接子将抗体与细胞毒性药物连接起来。它是与 ADC 和有效载荷释放曲线的稳定性相关的关键因素之一，因此对于 ADC 的最终治疗指数至关重要。理想的连接物不应诱导 ADC 聚集，并且有望限制有效载荷在血浆中的过早释放并促进活性药物在所需靶位释放
2、根据细胞中的代谢命运，大多数 ADC 药物采用了两种类型的连接物，包括可裂解和不可裂解连接子
3、可裂解连接体 利用体循环和肿瘤细胞的环境差异，准确释放游离的细胞毒药物，又可分为 化学裂解连接体（ hydrazone 和二硫键）和酶切连接体（葡萄糖醛酸键和肽键）。Hydrazone 是典型的 pH 敏感性连接子。它在血液循环中稳定，但是进入癌细胞中，在溶酶体和内体酸性条件下水解，释放细胞毒性物质。但是，它在血浆中偶尔也会发生水解，导致靶向性减低和脱靶效应。基于二硫键的连接子是另一种对化学敏感的可裂解连接子，其对还原性谷胱甘肽 (GSH) 敏感。血液中的 GSH 浓度明显低于癌细胞中的浓度，这种类型的连接子可以在血液系统中保持稳定，同时在 GSH 水平升高的癌细胞中特异性地释放活性载荷。酶敏感接头而言，肽基接头对溶酶体蛋白酶敏感，已用于多种 ADC。 溶酶体蛋白酶通常在癌细胞中过度表达，从而能够在肿瘤附近准确释放药物
4、不可裂解的连接体（如硫醚或马来酰亚胺基）对体内常见的化学和酶环境无反应。不可裂解连接体最大的优势是由于血浆稳定性的提高而具有较低的脱靶毒性。不可裂解连接体依赖于蛋白酶对 ADC 抗体成分的酶水解，最终释放出有效载荷“复合物”，即与抗体降解产物中的氨基酸残基连接的药物。
3.4 细胞毒性 payloads
1、细胞毒性载荷是 ADC 内化到癌细胞后发挥细胞毒性的弹头。由于静脉注射后只有约 2% 的 ADC 能够到达目标肿瘤部位，因此用作 ADC 载荷的化合物需要具有高效力（IC50 在纳摩尔和皮摩尔范围内）。目前，用于 ADC 的细胞毒性载荷主要包括强效微管蛋白抑制剂、DNA损伤剂和免疫调节剂。如 Table1 所示
2、微管是细胞骨架的主要成分，在细胞分裂，尤其在肿瘤细胞快速增殖过程中发挥重要作用。微管蛋白聚合促进剂靶向微管二聚体的 β 亚基来干扰微管生长，典型的 MMAE 和 MMAF 。在 14 种获批的 ADC 药物中，有5种以MMAE/MMAF为载荷。而微管蛋白聚合抑制剂则阻止微管二聚体聚合形成成熟的微管，典型的抑制剂有美登木素衍生物 DM1和DM4
3、DNA损伤剂的 IC50 值能够达到皮摩尔级别，因此与DNA损伤剂偶联的ADC比微管抑制剂有时更有效，并且可以独立于细胞周期起作用（与主要作用于有丝分裂期的微管蛋白抑制剂相比），甚至对那些抗原表达较低的细胞也有效。DNA损伤剂的具体机制主要包括：（i）DNA双链断裂，如加利车霉素；（ii）DNA烷基化，如多卡米星；iii）DNA插入，如拓扑异构酶I抑制剂；iv）DNA交联，如吡咯并苯二氮卓类（PBD）
4、除了传统的细胞毒素外，越来越多具有新机制的有效载荷被纳入ADC设计。例如，小分子免疫调节剂最近开始应用于新型ADC药物的开发，这些药物也称为免疫刺激抗体偶联物（ISAC）。新型有效载荷主要包括Toll样受体（TLR）激动剂和干扰素基因刺激剂（STING）激动剂
3.5 结合方法
1、除了选择抗体、接头和有效载荷外，小分子部分（即连接子加有效载荷）与抗体的连接方式对于成功构建 ADC 也很重要
2、抗体上赖氨酸和半胱氨酸残基的存在为结合提供了可访问的反应位点，早期的 ADC 药物通常通过适当的偶联反应利用预先存在的赖氨酸或半胱氨酸残基的随机结合。酰胺偶联（Amide coupling ）是最常用的方法，其中活性羧酸酯（当接头中可用时）用于将有效载荷连接到抗体上的赖氨酸残基。抗体通常含有大约 80-90 个赖氨酸残基，其中 40 个赖氨酸残基通常是可修饰的。通过与赖氨酸残基的随机偶联，不同数量（0-8）的小分子毒素可以附着到抗体上，从而导致drug-antibody ratio（DAR）分布范围较广。此外，由于赖氨酸残基分布在整个抗体轻链和重链中，抗体-抗原识别位点附近的偶联反应可能会降低 ADC 与靶标的结合
3、基于半胱氨酸的反应提供了另一种偶联方法。还原后，二硫键可以转变为可进行偶联反应的半胱氨酸残基。通常，IgG1抗体既有链间二硫键，也有链内二硫键。链间二硫键暴露在抗体外部，易于还原以暴露游离的半胱氨酸残基，为将小分子与抗体结合提供可用位点。由于结合位点数量有限且硫醇基团具有独特的反应性，使用半胱氨酸作为连接位点有助于降低 ADC 的异质性。根据还原率，可以生成DAR为 2、4、6和8的产品，与赖氨酸残基偶联的产品相比，其均质性更好。这是迄今为止商业产品中最常用的偶联方法。然而，值得注意的是，打开链间二硫键可能会破坏抗体的完整性
4、基于赖氨酸和半胱氨酸残基的随机结合通常具有许多缺点，这种偶联的稳定性有时不足，这会导致过早的有效载荷释放，从而导致脱靶毒性。此外，DAR 的均质性也很难实现控制。为了降低 ADC 的异质性，在新的 ADC 中开发了几种位点特异性结合策略，如 Table2 所示
5、首先，引入工程化的反应性半胱氨酸残基成为位点特异性结合的常用方法。Genentech 开发的 ThioMab 技术利用基因工程技术在曲妥珠单抗轻链 V110A 和重链 A114C 的特定位置插入半胱氨酸残基，然后用 MMAE 与半胱氨酸上的巯基偶联，合成位点特异性的抗 MUC16 ADC。生产的 DAR 为 2 的 ADC 比例高达 92.1%。
6、另一种位点特异性结合的方法是引入非天然氨基酸，包括N-乙酰-L-苯丙氨酸、叠氮甲基-L-苯丙氨酸和叠氮赖氨酸。这些非天然氨基酸中的特殊功能团使得位点特异性结合成为可能。此外，该结合是可控和定量的，可以生成具有均一DAR、高效、稳定性好和高安全性的ADC。
7、位点特异性 ADC 也可以通过糖基重塑和糖偶联产生。在抗体的 Fc 片段中，每条重链 CH2 结构域 N297 位上存在 N-糖，这使得反应位点能够通过糖基化与有效载荷结合。最近开发了一种用于 ADC 中位点特异性偶联的 pClick 技术。通过引入邻近激活交联剂，用叠氮基修饰的肽可以自发与抗体上最近的赖氨酸残基发生反应。并且叠氮基为与生物正交手柄修饰的有效载荷进行点击化学提供了可用位点。由于无需进行抗体工程改造和反应后处理，产量和抗体稳定性得到显著提高。pClick技术为ADC开发提供了一种更方便、更高效的位点特异性结合的新选择
4 ADC的作用机制
1、如 Fig4 所示，ADC的 mAb 与癌细胞上特异表达的靶抗原结合后，被细胞内吞形成早期内体，随后成熟为晚期内体，最后与溶酶体融合。细胞毒性载荷最终通过化学或酶介导在溶酶体中释放，通过靶向DNA或微管导致细胞凋亡或死亡。当释放的载荷具有渗透性和跨膜性时，还可能诱导 bystander effects ，从而增强 ADC 的疗效。这些 bystander effects 也可能改变肿瘤微环境，进而进一步增强 ADC 的杀伤作用
2、ADC的抗体Fab段可与病毒感染细胞或肿瘤细胞的抗原表位结合，而 FC 段可与杀伤细胞（NK细胞、巨噬细胞等）表面的 FC receptor 结合，从而介导直接杀伤作用，涉及ADCC、ADCP和CDC效应。ADC的抗体组分还可以特异性地与癌细胞的表面抗原结合，抑制抗原受体的下游信号转导，诱导细胞凋亡。
5 多代 ADC
1、第一代 ADC 的特点：传统化疗药 + 鼠源抗体 + 不稳定的 linker 。脱靶毒性较高，免疫源性高，DAR 异质性高，药代动力学/药效动力学不一致
2、第二代 ADC 的特点：效价高的payloads + 人源化抗体 + 稳定性提高的linker。新一代的payloads 水溶性更高，偶联效率更高，不会引起抗体的聚集。DAR 的分布更均一。三个重要组成的提升使得第二代 ADC 疗效更好，更加安全。但是，部分 ADC 仍有脱靶毒性、聚集、DAR 过高导致清除效率高的问题
3、第三代 ADC 的特点：PBD、微管蛋白和免疫调节剂等更有效的payloads + 全人源的抗体或Fabs + 稳定性提高的linker。一致 DAR 的 ADC 表现出更少的脱靶毒性和更好的药代动力学效率。第三代 ADC 具有更低的毒性和更高的抗癌活性，以及更高的稳定性。
6 已批准的 ADC
7 ADC面临的主要挑战
7.1 复杂的药代动力学特征
1、ADC 主要通过静脉给药，给药后在体循环中主要存在三种形式，即完整ADC\裸抗体\游离的payload。在典型的 ADC 药代动力学特征中，随着 ADC 的内吞和抗体清除，完整 ADC 和裸抗体的浓度均持续降低
2、影响抗体清除的因素主要包括单核吞噬细胞系统和 FcRn 受体介导的再循环。因此，与传统小分子药物相比，ADC 和裸抗体通常具有更长的半衰期。这些因素，再加上患者间高度差异，建立 PK 和 PD 模型来描述 ADC 的临床特征并协助设计新的 ADC 具有挑战性
7.2 不可避免的副作用
1、在已批准的 14 种 ADC 中，最常见的严重副作用（3 级或以上）是血液毒性，包括中性粒细胞减少、血小板减少、白细胞减少和贫血。血液毒性以及肝毒性和胃肠道反应可能与细胞毒性有效载荷过早释放到血液循环中有关。这与主要影响快速增殖的健康细胞的传统化疗药物一致
2、ADC 的抗体部分诱导的免疫反应可能引起继发性损伤，导致肾毒性
3、ADC 治疗期间潜在的肺毒性作用如间质性肺疾病(ILD)。ILD 的具体作用机制尚不明确，有人推测其中一个可能与健康肺细胞对 ADC 的不良摄取以及 ADC 释放的游离载荷有关。由于肺脏中血流最丰富，滞留时间最长，ADC 的不良摄取和血液中的游离载荷最容易发生在肺脏，从而诱发 ILD
7.3 肿瘤靶向和有效载荷释放
1、对于ADC药物，负载的递送依赖于形成的ADC-抗原复合物通过抗原依赖性的内吞作用或抗原非依赖性的胞饮作用内化。内化后，ADC抗原复合物会被运输到内体或溶酶体，释放负载。当负载通过酸性可裂解的连接体连接时，很可能在早期内体中被释放，而对于需要特异性蛋白酶作用的ADC，负载的释放将发生在晚期内体或溶酶体中
2、无论负载释放途径如何，一些ADC具有“旁观者效应”，可以在不表达靶抗原的情况下影响周围的癌细胞。旁观者效应需要有效载荷穿过细胞膜，因此可裂解接头释放的非极性有效载荷是首选，因为极性分子更有可能留在细胞中
7.4 耐药性
1、ADC 开发的另一个挑战是耐药性。ADC 的耐药机制尚未得到充分表征。由于 ADC 的潜在 MOA，它们可能更加复杂和多样化。目前的证据表明，肿瘤可以通过多种方式逃避 ADC 的活性，例如降低抗原的表达水平、改变细胞内运输途径、对有效载荷产生耐药性
8 参考文献
[1] Fu, Z., Li, S., Han, S. et al. Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy. Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00947-7
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