2020-12-04 熊果酸+耐药非小细胞肺癌 7分-可

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doi： 10.1111 / bph.14793

背景和目的

在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中，上皮生长因子受体（EGFR）的L858R / T790M突变是治疗获得性耐药的主要原因，从而限制了它们的治疗效果。因此，鉴定能够优先治疗具有L858R / T790M突变的NSCLC的药物至关重要。在这里，我们评估了熊果酸（一种从草药中分离的活性成分）对具有L858R / T790M突变的H1975细胞的影响。

实验方法

基因表达综合（GEO）概况分析用于检测携带EGFR突变的NSCLC细胞中差异表达的基因。AnnexinV‐FITC / PI，TUNEL染色，MTT，伤口愈合，RT‐PCR，qRT‐PCR，western blots，免疫染色，双荧光素酶报告基因和ChIP‐PCR被用来研究熊果酸在体外和体内的作用。

关键结果

癌症抗原家族45成员A2（CT45A2）在H1975细胞中高度表达。H1975细胞中CT45A2的异位表达增加了体外细胞的增殖和运动能力。沉默CT45A2的表达大大减弱了H1975细胞的运动性和生长。熊果酸的抗癌作用严重取决于H1975细胞中CT45A2的表达。熊果酸抑制转录因子TCF4和β-catenin信号传导介导的CT45A2基因转录。

结论

CT45A2是具有EGFR T790突变的NSCLC的新型致癌基因。熊果酸通过负调节β-catenin/ TCF4 / CT45A2信号通路来诱导H1975细胞凋亡并抑制其增殖。因此，熊果酸可能是具有EGFR-L858R / T790M突变的NSCLC的潜在候选治疗药物。

3.1。UA抑制具有EGFR L858R / T790M突变的H1975细胞的细胞增殖和运动

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熊果酸抑制具有EGFR L858R / T790M突变的H1975细胞的细胞增殖和运动。（A）将H460，H1299，HCC827和H1975细胞与5μmolL -1的厄洛替尼孵育48小时，并通过MTT分析对细胞活力进行分析。（B）用齐墩果酸（OA，50μmolL -1），甘草次酸（GA，50μmolL -1），熊果酸（UA，50μmolL -1），积雪草酸（AA，50）处理H1975细胞μmolL -1）和厄洛替尼（5μmolL -1）48小时。通过MTT测定法在490nm的吸光度下测量细胞活力。（C）用不同浓度的UA，AA，GA，OA和厄洛替尼处理H1975细胞48小时。通过MTT测定法在490nm的吸光度下测量细胞活力。（D）不同浓度的UA和AA对人正常肺上皮（BEAS-2B）细胞的细胞毒作用。使用MTT测定法分析细胞活力。（E）将H1975细胞用UA（25μmolL -1）处理，然后用AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色以通过流式细胞仪检测细胞凋亡。（F）用UA（25μmolL -1处理H1975细胞）在不同时间（24、48、72小时），通过划痕伤口愈合测定法评估细胞运动性的变化。比例尺= 500μm。显示的数据是来自五个独立实验的平均值±SD（n = 5）。* P <0.05，如所示有显着差异；ns，无重大影响

3.2。UA在体内抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡

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熊果酸（UA）抑制异种移植肿瘤的生长并诱导体内凋亡。（A）将H1975细胞皮下注射到无胸腺裸小鼠的右背侧。每天一次给小鼠注射UA（25 mg kg ^-1-1天^-1）或溶媒（含1％DMSO的生理盐水）或erlotinib（20 mg kg ^-1-1天^-1）每天一次，持续18天。杀死小鼠并收集肿瘤组织。尸检时取每个治疗组的小鼠和肿瘤的照片。（B）根据以下公式，通过测量单个肿瘤的2个直径来计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm ³）＝（长×宽² ×0.5）。所示数据是从实验获得的值的平均值±标准误。P <0.05，如所示有显着差异。（C）上图：显示了代表性的肿瘤例子。下：每只小鼠的肿瘤重量。所示数据为平均值±SEM。 P＜0.05。（D）左：取自H1975异种移植物的肿瘤样品，固定并石蜡包埋。切片用于通过TUNEL染色检查凋亡细胞。白色箭头表示具有特征性凋亡形态的TUNEL阳性细胞。显示了代表性图像。比例尺= 200μm。右：图中TUNEL染色结果的分析和统计​图2D2D左。从5个高倍视野（HPF）量化TUNEL阳性细胞的数量。（E）在H＆E染色后，通过光学显微镜评估肝脏和肾脏样品中的毒性程度。显示了代表性图像。比例尺= 200μm。显示的数据是来自车辆组和UA组的五个独立实验的平均值±SD；厄洛替尼组的三个独立实验。* P <0.05，与指示值显着不同

3.3。CT45A2在带有EGFR L858R / T790M的H1975细胞中高表达

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CT45A2在具有EGFR L858R / T790M突变的H1975细胞中高表达。（A）分析对抗癌药物吉非替尼具有广泛敏感性的基线非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系。GEO数据集结果用于定义吉非替尼敏感性的基因表达特征。吉非替尼对各种NSCLC品系（HG-U133B）的影响。ZDHHC24，EREG，RAP2B，GNA12，EGLN1，CT45A2和TMEM18等基因在耐吉非替尼的H1975细胞中高度表达。（B）提取HCC827和H1975细胞的总RNA，并进行Q-PCR检查指示基因（ZDHHC24，EREG，RAP2B，GNA12，CT45A2）的mRNA水平。内源GAPDH RNA用作内部对照。（C）用过表达CT45A2的质粒转染H1975细胞，并通过MTT测定法测量细胞活力。通过蛋白质印迹检测指示的蛋白质。中间的图显示了来自蛋白质印迹的平均值。通过Image J软件使用灰度值分析对蛋白质水平进行定量。（D）用针对CT45A2的siRNA（siCT45A2）或阴性对照siRNA（siNC）转染H1975细胞，通过PCR检测指示的基因。中间的图显示了PCR的平均值。通过Image J软件分析CT45A2 mRNA水平。通过MTT测定评估细胞活力。（E）用过表达CT45A2的质粒转染H1975细胞，并使用伤口愈合试验研究细胞迁移率。比例尺= 500μm。（F）将H1975细胞用siCT45A2或siNC转染。通过伤口愈合试验评估细胞运动性。比例尺= 500μm。所示数据为五个独立实验的平均值±SD * 通过伤口愈合试验评估细胞运动性。比例尺= 500μm。显示的数据为五个独立实验的平均值±SD * 通过伤口愈合试验评估细胞运动性。比例尺= 500μm。所示数据为五个独立实验的平均值±SD P <0.05，与指示值显着不同；ns，*无重大影响

3.4。UA诱导的H1975细胞凋亡需要CT45A2

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熊果酸（UA）在具有EGFR L858R / T790M突变的H1975细胞中诱导细胞凋亡并抑制细胞运动。（A）用CT45A2-pRK5-Flag或pRK5-Flag转染H1975细胞，然后将其与UA（25μmol/ L）一起孵育24小时，并通过MTT增殖测定评估细胞活力。（B）用针对CT45A2的siRNA（siCT45A2）或阴性对照siRNA（siNC）转染H1975细胞。通过PCR检测到所指示的基因。通过MTT测定评估细胞活力。（C）将H1975细胞用UA（25μmolL -1）处理，然后用AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色以通过流式细胞仪检测细胞凋亡。显示的数据是来自五个独立实验的平均值±SD。* P <0.05，如所示有显着差异；ns， 非重大影响

3.5。UA通过H1975细胞中的TCF4位点抑制CT45A2基因启动子

半定量检测显示，在耐吉非替尼的H1975细胞中上调的基因中，UA被发现抑制CT45A2的mRNA表达，但不抑制其他基因（图2）。 ​（图5a）5a）或在H1975细胞中进行定量RT-PCR分析（图 ​（图5b）。5b）。因此，我们假设UA可以在mRNA转录或mRNA衰变的水平抑制CT45A2基因的表达。为了验证这一假设，我们使用放线菌素D（4μg ·ml ^-1）终止所有基因转录，然后观察了UA处理后H1975细胞中CT45A2的mRNA半衰期（图​（图5c）。5C）。结果表明，UA无法影响CT45A2 mRNA的半衰期（图​（图5c，d）。5）。因此，UA介导的CT45A2下调很可能发生在转录水平。

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熊果酸（UA）通过H1975细胞中的TCF4位点抑制CT45A2基因启动子。（A）将HCC827和H1975细胞与UA（25μmolL -1）和厄洛替尼（5μmolL -1）孵育12小时。提取上述处理过的细胞的总RNA，并进行RT-PCR检查指定基因（ZDHHC24，EREG，RAP2B，GNA12，CT45A2）的mRNA水平。（B）用UA（25μmolL -1）和厄洛替尼（5μmolL -1）处理H1975细胞12小时。提取上述处理过的细胞的总RNA，进行Q-PCR检查指定基因（ZDHHC24，EREG，RAP2B，GNA12，EGLN1，CT45A2，TMEM18）的mRNA水平。内源性β-肌动蛋白RNA被用作内部对照。（C）UA（25μmolL -1）不会影响H1975细胞中CT45A2 mRNA的半衰期。UA处理H1975细胞4小时后，加入放线菌素D（Act D，4μgmL -1）。在指定的时间收获细胞用于总RNA提取，并通过PCR测量mRNA水平。GAPDH用作对照。（D）通过半定量PCR分析评估CT45A2表达水平。（E）CT45A2启动子的序列缺失突变体分析。将H1975细胞用人CT45A2启动子-荧光素酶构建体转染，并在无UA或与UA（25μmolL -1）一起孵育12小时。截断的CT45A2s的转录活性通过双荧光素酶报告基因测定法确定。（F）通过PROMO HOME PAGE预测人CT45A2基因的转录因子结合位点。（G）将在特定TCF4位点具有突变的CT45A2启动子构建体转染到细胞中，并测定荧光素酶活性以鉴定与UA调节CT45A2启动子活性有关的特异性TCF4结合位点。（H）敲除TCF4会降低H1975细胞中的CT45A2荧光素酶报道分子活性。（I）通过ChIP测定结合PCR研究了TCF4与CT45A2启动子的结合。β-肌动蛋白基因用作内部对照。显示的数据是来自五个独立实验的平均值±SD。* P <0.05，＃ P <0.05，如所示有显着差异；ns，无重大影响

3.6。UA在体内外均抑制β-catenin/ TCF4信号通路

由于UA降低了CT45A2启动子上TCF4的结合；我们调查了TCF4是否参与了UA对CT45A2 mRNA水平的抑制。将有或没有用siNC或siTCF4转染的H1975细胞暴露于UA并进行半定量PCR。结果表明沉默TCF4后，CT45A2 mRNA水平显着降低。此外，TCF4沉默后，UA对CT45A2基因表达的抑制作用大大减弱（图​（图6A）。6一种）。然后，我们评估了UA抑制H1975细胞增殖对TCF4的依赖性。MTT分析表明，在TCF4沉默的细胞中，UA对H1975细胞生长的抑制作用大大减弱（图​（图6B）。6B）。此外，Annexin V-FITC / PI分析还显示，TCF4沉默可显着减弱UA诱导的H1975细胞凋亡（图​（图6C），6C），表明UA的作用取决于TCF4。
已知转录因子TCF4是发展和癌症中Wnt /β-catenin信号通路的介体。因此，我们研究了UA对H1975细胞中Wnt /β-catenin/ TCF4信号通路的影响。如图所示​图6d6d，与对照组相比，UA处理抑制了H1975细胞中Ser- ³³ / ³⁷ / Thr ⁴¹处β-catenin的磷酸化和TCF4的水平，并诱导了Ser ⁹上GSK-3β的磷酸化。但是，UA对总β-catenin和GSK-3β的蛋白质水平没有显着影响。UA还抑制了β-catenin进入细胞核的转运，导致β-catenin水平显着下降（图​（图6d，e）。6d，e）。因此，β-catenin/ TCF4信号通路参与了UA对TCF4表达的调节。

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