文章题目：Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing
中文题目：多组学分析揭示了疤痕和再生伤口愈合过程中不同的分子事件
见刊时间：2022.02
期刊名称：Cell Stem Cell
影响因子：25.269
实验平台：scRNA-seq (10X Genomics)、蛋白质组学（TIMSTOF）
DOI：10.1016/j.stem.2021.12.011
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研究内容（接上文）
之前研究者做了多模式分析，但接下来他们是如何确定了Trps1在再生中的功能意义呢，请见如下研究内容：
4、伤口中纤维化和再生轨迹标志物的分析
研究者之前的分析表明，空间定位——而不仅仅是细胞数量——可能决定了PBS和维替泊芬伤口中不同的表型，因此他们对Trps1 (Wnt通路调节因子)、YAP(机械转导信号)和Dpp4 (En-1系瘢痕成纤维细胞；图2M)进行了IF分析。结果显示，在PBS与替泊芬伤口中，Dpp4+细胞(EPFs)显著增加，特别是在真皮深处(图2M右)。与维替泊芬抑制机械转导一致，YAP在PBS伤口中的表达高于维替泊芬伤口或UW皮肤(图2M)。Trps1在对照组伤口中表达极低，但在维替泊芬伤口中大量表达，基于人工智能的成千上万个细胞中Trps1核定位定量显示，维替泊芬伤口中有较高的核Trps1+成纤维细胞(图2N)。尽管如之前所述，UW皮肤Trps1表达仅限于基底上皮和真皮乳头 (图2M，左)，但在维替泊芬创伤中，在再生HF周围发现了高核Trps1+细胞簇(图2M，下)。
PBS和维替泊芬治疗的一个显著区别是后者在30天内出现再生HF；控制伤口形成裸露区域。研究者想知道他们的成纤维细胞轨迹分析是否可以揭示HF/腺体再生的主要调节因子。Trps1是一种锌指转录因子，在再生臂中强烈富集(图2F和3C)，是首选的候选因子。Trps1曾被报道为一种新的Wnt信号“主调控因子”，并且多项研究表明Trps1参与HF形态发生，Trps1活性异常与人类毛发过度生长(多毛症)有关，使其成为一种有前途的驱动创面HF再生的候选者。研究者结论表明，Trps1+细胞在再生伤口中富集，并在新生HF周围空间聚集(图2M和2N)。据报道，Trps1通过竞争共享的YAP/TEA结构域(TEAD)基因组结合位点在转录上调节YAP信号。鉴于再生轨迹以机械转导降低和Trps1升高为特征，他们推测Trps1可能是创面再生的关键调节因子。
基于综合多模态分析，研究者试图验证不同伤口表型中关键基因的相关性。他们选择了四种标记基因来区分不同途径(例如，机械激活和Wnt信号)和纤维化或者再生臂：Ankrd1 (YAP靶基因)，Trps1 (Wnt调节因子)，Rspo1 (Wnt激动剂)和Dpp4 (EPF谱系标记；图2C, 2F, 3B和3C)。分析结果显示，这些基因共同分化了机械激活/促纤维化(Dpp4和Ankrd1)和再生(Rspo1和Trps1)通路。为了探测关键基因的空间分布，他们对Ankrd1、Dpp4、Trps1和Rspo1进行了多重RNAscope原位杂交。在POD 14维替泊芬伤口中，在真皮表面发现含有Rspo1和Trps1 RNA颗粒的成纤维细胞聚集在内陷上皮周围，与新生HF一致(图5A和图5C下)。相比之下，POD 14 PBS创面中的Rspo1+和Trps1+细胞在真皮中随机分散(图5A和图5C上)。POD 30是纤维化/再生创面表型差异最大的时间，PBS创面成纤维细胞有更多的Dpp4和Ankrd1，而维替泊芬创面有更多的Rspo1和Trps1 RNA颗粒，集中在再生HF周围(图5B和5D)。从数千个细胞中量化颗粒证实了这些趋势(图5E和5F)，支持了在YAP抑制的(低Ankrd1)伤口中ENF介导的愈合(低Dpp4)通过Wnt激活(高Trps1和Rspo1)产生HF再生的发现。
图5. 瘢痕和再生过程中成纤维细胞的空间转录组学分析
6、确定Trps1在再生中的功能意义
考虑到Trps1在Wnt信号、HF形态发生和YAP调节中的重要性，以及Trps1+成纤维细胞与HF再生的空间关系，他们试图确定Trps1在创面再生中的功能。他们首先进行了成纤维细胞特异性Trps1 OE，以评估Trps1是否足以在正常瘢痕条件下的伤口再生。我们开发了慢病毒载体，编码带有蛋白水解T2A连接子的floxed mTrps1:EGFP转基因基因(成功转导的成纤维细胞是增强的绿色荧光蛋白[EGFP]+)，当将其皮下注射到它莫西芬诱导的Col1a1-CreERT;Ai9小鼠(成纤维细胞表达报告基因)时，使成纤维细胞特异性Trps1 OE。为了针对不同的修复阶段，它们在早期(POD−3和7)都过表达Trps1，以研究其在早期过程中的作用，如炎症、肉芽形成和早期ECM合成，以及晚期(POD 7和17)，在疤痕(PBS)伤口中，对后期过程如成纤维细胞迁移、ECM沉积和早期重塑。对照组创面(Trps1-OEC)注射FLEXon EGFP慢病毒。结果表明，Trps1-OEC创面形成疤痕，而Trps1-OEE和Trps1-OEL创面疤痕不太明显，且能再生HF(图6A)。组织学证实Trps1表达增加(图6C)，并在Trps1- OEE和Trps1- OEL伤口中显示少量再生附件结构和更多UW样ECM(图6B, 6D，右和6E)；这些发现在定量上得到了证实，明显更多的HF/腺体和明显更高的(即更多的UW样)ECM评分(图6D)。与Trps1- OEE相比，Trps1- OEL伤口的再生作用更明显，这表明Trps1的促再生作用可能在早期愈合时间点最大。总的来说，这些发现表明Trps1 OE在一定程度上足以促进伤口再生。
接下来，为了评估Trps1对维替泊芬诱导的伤口再生是否必要，他们开发了miR30-mTrps1慢病毒载体，当对小鼠皮下注射该载体时，使成纤维细胞特异性Trps1 KD(成纤维细胞表达报告基因，转导细胞表达EGFP)。他们在早期时间点(POD−3/7;Trps1-KDE)和晚期时间点(POD 7/17;Trps1-KDL) 敲除了Trps1。结果显示，Trps1-KDC伤口显示毛发再生且无瘢痕，而Trps1-KDE和Trps1-KDL伤口形成无毛瘢痕(图6F；IF证实Trps1表达下降，图6H)。
组织学上，Trps1-KDE和Trps1-KDL伤口ECM再生完全消失，取而代之的是瘢痕ECM(图6G, 6I右，6J)。有趣的是，仅在Trps1- KDL伤口中观察到附件结构的显著丢失(图6G右和6I)，这意味着在愈合后的维替泊芬诱导的附件再生(如HF)中特别需要Trps1。总的来说，这些数据表明Trps1是伤口完全再生所必需的，在早期和晚期愈合中具有不同的作用。
综上所述，研究者综合多模式分析区分了两种修复轨迹。第一种是EPF介导的(Dpp4+)，其特征是机械激活(高核YAP, Ankrd1+，Trps1−)，并导致疤痕ECM。第二种是ENF介导的(Dpp4−)，缺乏机械激活(低核YAP, Ankrd1−，Trps1+)，通过Wnt激活导致正常ECM和HF的再生。
图6. 成纤维细胞靶向慢病毒Trps1过表达和敲除
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主要结论
此研究为利用细胞表面条形码和多组学分析提供了一个框架，极大地提高了组织动力学的分析，并提出了一种在ENF介导修复中驱动再生的潜在机制。与YAP竞争共享靶位点的Trps1与纤维化较少的转录轨迹相关，并在空间上与HF再生相关。他们的研究结果表明，Trps1和下游的Wnt信号也发生在疤痕伤口成纤维细胞中，但在没有YAP抑制的情况下，表型上由YAP信号主导。这可能表明再生是一种“默认的”修复途径，被机械激活的纤维化趋势所取代。
参考文献
Mascharak S, Talbott HE, Januszyk M, Griffin M, Chen K, Davitt MF, Demeter J, Henn D, Bonham CA, Foster DS, Mooney N, Cheng R, Jackson PK, Wan DC, Gurtner GC, Longaker MT. Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing. Cell Stem Cell. 2022 Feb 3;29(2):315-327.e6. doi: 10.1016/j.stem.2021.12.011. Epub 2022 Jan 24. PMID: 35077667; PMCID: PMC8988390.
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