其实前段时间小编已经给大家分享了单基因泛癌分析，拿着自己研究的基因，通过Sangger box云平台就可以得到了属于自己的单基因分析报告（如果有兴趣的话可以去翻一下那篇文章） 强调：代码编程和网页小工具只是数据分析方法，重要是研究思路，如何将分析结果将生物学含义联系起来才是至关重要的点。 下面这篇文章的分析内容比小伙伴们拿到的那份分析报告内容少了很多，但是文章分数却不低，文章的题目虽然是关于胃癌的，但是作者研究的研究思路却是泛癌，值得小伙伴们借鉴。一起来看看吧！
TGFβ2 is a prognostic-related biomarker and correlated with immune infiltrates in gastric cancer
TGFβ2表达水平、生物标志物和免疫浸润与胃癌患者预后的关系
发表期刊：J Cell Mol Med.
发表日期：2020 Jun 12
影响因子：4.65DOI: 10.1111/jcmm.15164
一.分析流程
二.研究背景
在所有的癌症中，胃癌（GC）是最致命的癌症之一，这种现象在东亚尤为普遍。胃癌患者由于肿瘤容易发生转移导致患者预后很差。研究发现，免疫分子可以调节GC的发展和进程，因此，有许多不同的免疫疗法可以作为治疗胃癌的手段。
TGF-β是一种细胞因子与恶性肿瘤进展密切相关，其基因家族具有三个成员，TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。其中TGF-β1和TGF-β2通过影响基质细胞和肿瘤细胞的活性，以调节肿瘤进展。TGF-β信号传导可以诱导强烈的免疫抑制，在肿瘤微环境中的，通常由肿瘤细胞和免疫细胞分泌。TGF-β是肿瘤微环境的有效调节剂，因为它可以调节肿瘤细胞，免疫细胞和基质细胞之间的相互作用，同时调节细胞因子的产生。外周血单个核细胞（PBMC）是能够分泌细胞因子的关键免疫细胞，当它们与癌细胞相互作用时，它可以诱导或损害肿瘤特异性免疫反应，从而确定肿瘤是否经历了凋亡性死亡或能够发展为恶性肿瘤。
作者使用包括Oncomine，PrognoScan和Kaplan-Meier在内的公共数据库对TGFβ2与患者预后之间的关系进行系统的分析并且使用肿瘤免疫细胞评分网页工具（TIMER）进一步研究了TGFβ2表达水平与肿瘤免疫细胞浸润之间的关系。
三.材料与方法
1. Oncomine数据库分析
Oncomine数据库是将86733个样本和715个基因表达谱数据整合在一起的综合数据库，目的是便利与世界各地的研究者进行数据挖掘工作。因此，作者使用该数据库分析了各种肿瘤类型中TGFβ2表达与预后之间的关系。
2. PrognoScan数据库分析
PrognoScan数据库整合了大量带有预后信息的芯片数据集，可以用来分析基因与患者预后的关系。因此，作者使用这个数据库来评估TGFβ2表达情况与患者预后之间的关系。
3. Kaplan-Meier曲线分析
使用Kaplan-Meier曲线展示21种不同类型癌症患者生存情况与基因表达的关系，利用kmplot数据库来分析胃癌、乳腺癌、卵巢癌和肺癌患者TGFβ2表达情况与预后的关系，分析临床病理因素和TGFβ2对胃癌患者预后的影响。
4. TIMER数据库免疫评分分析
TIMER数据库分析多种癌症中免疫细胞评分的数据库，作者TIMER数据库评估特定肿瘤类型中TGFβ2表达水平的差异，然后分析了TGFβ2的表达水平与免疫细胞亚群的浸润程度之间的关系。进一步进行了Kaplan-Meier曲线分析，以探讨患者生存率的差异与基因表达或免疫细胞浸润的关系。
5. GEPIA数据库分析
GEPIA是一个在线数据库，它整合了TCGA数据和GTEx数据集中9736个肿瘤样本和8587个正常对照样本的RNA-seq数据。作者使用该数据库来验证多种肿瘤类型中TGFβ2表达与患者预后之间的关系，并进一步验证TGFβ2表达与肿瘤免疫细胞浸润相关的生物标记物关系。
6. 统计分析
使用log-rank检验是否存在差异显著性，使用Spearman's 相关分析来计算变量之间的相关性。
四.重要结论
1. 首先使用Oncomine数据库分析了多种肿瘤组织与正常组织的表达情况，结果显示，与其他癌种相比，基因TGFβ2在脑癌、乳腺癌、结直肠癌、食管癌、直肠癌、胃癌、头颈癌、肝癌、肾癌和胰腺癌中的表达水平较高，与正常组织相比在脑组织、乳腺、肾、肺癌和前列腺癌组织表达量较低（图1A）。作者进一步使用TCGA和TIMER数据库评估TGFβ2在特定肿瘤类型中的表达差异，结果显示，在胆管癌（CHOL）、结肠腺癌（COAD）、肝细胞癌（LIHC）、胃腺癌（STAD）和甲状腺癌（THCA）中TGFβ2的表达量显著高于正常对照组，而在膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺浸润癌（BRCA）、肾嫌色细胞增多症（KICH）、肾乳头状细胞癌（KIRP）、肾透明细胞癌（KIRC）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）和子宫体子宫内膜癌（UCEC）中TGFβ2的表达量显著低于正常对照组（图1B）。
不同癌种中癌症组织和正常组织TGFβ2表达的差异性分析
2.使用PrognoScan数据库分析TGFβ2的表达水平与癌症患者预后之间的关系，结果显示；多种癌症类型的患者预后和TGFβ2表达水平之间存在显著相关性，包括乳腺癌、肺癌、血液癌、卵巢癌、前列腺癌、脑癌和结肠癌（图2A-H）。进一步使用Kaplan-Meier数据库展示TGFβ2的表达水平与各种癌症类型预后之间的关系，结果表明:TGFβ2表达量升高胃癌患者（OS HR=1.62，95%CI(1.35-1.98)，P=1.97e-7；PFS HR=1.82，95%CI(1.48-2.24)，P=7.6e-9）和卵巢癌患者（OS HR=1.18，95%CI(1.04-1.34)，P=0.013；PFS HR=1.35，95%CI(1.18-1.55)，P=1.4e-5）预后较差，且显著相关（图2I-L）;TGFβ2表达量降低，肺癌患者（OS HR=0.83，95%CI=0.73-0.94，P=0.0029；PFS HR=0.78，95%CI=0.64-0.94，P=0.01）预后较差，且显著相关（图2M-N）而TGFβ2的表达量与乳腺癌患者的预后无明显关系。因此，通过上述分析可以得出结论，TGFβ2的表达水平与多种类型肿瘤患者的预后差显著相关。
TGFβ2表达水平与泛癌患者预后或复发的关系
3.接下来，作者进一步使用Kaplan-Meier数据库来分析TGFβ2表达情况与患者临床病理之间的关系。结果发现，除Stage I之外，TGFβ2的表达水平与OS、DFS及患者性别、肿瘤分期、T分期、N分期、M分期、Lauren分类和分化显著相关（表1）。作者进一步发现TGFβ2的表达水平与胃癌患者的淋巴结转移程度密切相关，淋巴结转移是胃癌患者最常见的转移类型，与患者预后直接相关，在胃癌中，TGFβ2表达水平和DFS的关系而言，N期的HR最高（HR=4.22（1.56-11.44，P=0.0020），这表明TGFβ2的表达可能通过影响胃癌患者的淋巴结转移而影响胃癌患者的预后。
胃癌淋巴结转移患者中TGFβ2表达水平与预后的关系
4. 在癌症患者中，患者的生存率和淋巴结转移的相关性是通过淋巴细胞浸润肿瘤的频率预测的。因此，作者使用TIMER数据库计算39种肿瘤类型免疫细胞评分与TGFβ2表达水平之间的相关性。作者发现在24种癌种中TGFβ2的表达水平与肿瘤浸润程度具有显著相关性，其中，19种癌种与CD8+T细胞免疫评分、21种癌种与D4+T细胞免疫评分、23种癌种与巨噬细胞免疫评分，23种癌种与中性粒细胞免疫评分、23种癌种与树突状细胞免疫评分有显著的相关性。TGFβ2表达水平与间皮瘤（MESO）中B细胞免疫评分、CD4+T细胞免疫评分、CD8+T细胞免疫评分、巨噬细胞免疫评分、中性粒细胞免疫评分无显著的相关性（图3A）。与此同时，胃腺癌（STAD）中，TGFβ2的水平与肿瘤纯度之间没有这种关系，但是在同一类型的癌种中，TGFβ2的表达与CD8+T细胞（R=0.139，P=7.24e-03）、CD4+T细胞（R=0.258，P=5.75e-07）、巨噬细胞（R=0.442，P=3.77e-19）、中性粒细胞（R=0.124，P=1.68e-02）和树突状细胞（R=0.248，P=1.29e-05）的水平显著相关（图3B）。最后，使用Kaplan‐Meier曲线分析免疫细胞评分与MESO和STAD中TGFβ2表达水平之间的关系，作者发现巨噬细胞免疫评分（P=.004）和TGFβ2的表达水平（P<.001）与STAD预后显著相关（图3C），而在MESO中患者的预后与免疫细胞评分或TGFβ2表达水平没有显著相关（图3D）。这些表明TGFβ2在胃癌免疫细胞浸润中起着重要的调节作用，对巨噬细胞浸润的调节作用特别明显。
胃癌中TGFβ2表达水平与免疫细胞评分的关系
5. 利用TIMER和GEPIA数据库，以MESO为对照组，进一步探讨了TGFβ2表达与STAD免疫细胞浸润水平之间的关系，评估了特定的细胞亚群中TGFβ2表达情况与parkers水平之间的相关性。结果显示，在STAD中患者中，TGFβ2的表达水平与STAD中大多数单核细胞、TAM、M1和M2巨噬细胞标志物的表达相关。尤其是，与STAD中的单核细胞标记物（CD86、CD115）、TAM标记物（CCL2、IL10）、M1巨噬细胞标记物（INOS、IRF5、COX2）和M2巨噬细胞标记物（CD163、VSIG4、MS4A4A）显著相关（P<0.0001；图4A-H）。
TGFΒ2表达水平与免疫标志物表达水平之间的相关性
五.总结
在本研究中，作者Oncomie数据库和GEPIA数据库分析了TGFβ2的表达水平与33种不同类型癌症的预后相关性，揭示了许多癌症中TGFβ2在肿瘤组织与正常组织之间表达水平存在明显差异。这项研究的另一个发现，TGFβ2的表达情况与多种癌症类型，尤其是GC中的免疫浸润程度相关。例如，TGFβ2表达水平与巨噬细胞浸润程度呈正相关，而与STAD中CD8 +，CD4 +，DC和中性粒细胞浸润的程度呈弱正相关。进一步发现巨噬细胞浸润与GC预后显著相关。此外，研究还发现到TGFβ2与某些免疫标记基因表达之间有很强的相关性。
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