什么是线粒体基因
线粒体是参与细胞凋亡启动和执行的主要细胞器之一。线粒体基因在大多数细胞中表达，其表达水平是细胞类型特异性的。也就是说这个也是和细胞类型及其状态有关系的。
为什么scrna-seq需要处理线粒体
因为线粒体基因的高表达水平可能是:
- 样品质量差，导致大量细胞凋亡或裂解。
- 特定样本的生物学，例如肿瘤活检，可能由于代谢活动和/或坏死而增加线粒体基因表达。
凋亡细胞表达线粒体基因，并将这些转录产物输出到哺乳动物细胞的细胞质中。例如，当凋亡的细胞被放入正常的细胞悬液中，会检测到更多的线粒体基因。检测到的线粒体膜占总膜的百分比如图所示
image.png
线粒体是参与细胞凋亡启动和执行的主要细胞器之一 。细胞凋亡的过程依赖于一系列信号事件,包括线粒体基因表达的增加和半胱天冬酶的激活。 因此,我们在计算每个样本中源自线粒体基因表达的UMIs数量时,评估了独特转录本的比例（percentage counts of MT-）
在> 80%活细胞的高质量样品中,我们只检测到低比例的线粒体细胞(约3%) 与预期的一样,在只包含20%活细胞(74%)的Digitonin高样本中,线粒体转录本的数量最高 相比之下,含有50%活细胞的样本只显示线粒体基因表达略有增加(5-7%),这表明存活率确实与观察到的线粒体转录本数量相关（线粒体基因在细胞中counts数越多，表明该细胞活力越弱）。
被裂解的细胞或细胞膜被破坏的细胞释放它们的细胞质转录本,而线粒体转录本可能仍然保留在双膜结合的线粒体内 具有完整线粒体的裂解细胞可能被gems包裹,这也增加了检测到的线粒体转录片段的概率
如何处理
一般我们建议卡到15%以内。
当然还是要看这群细胞为什么会高。可以不卡阈值直接做降维分群,然后按分群来看小提琴图,如果只有一个或几个细胞群有差异的线粒体转录上调（把每个分群的差异基因拉出来看MT-基因有没有高表达）和低总UMI计数（某个cluster他的counts数很少），质量差的细胞通常有低总UMI计数，很少有上调基因(表明低总基因表达)，而只有MT基因过表达。例如，在下面的图中，您可以看到基于图形的聚类t-SNE图中聚类1(顶部的青色聚类)的基因表达。与上述鉴定死亡细胞的标准一致，在这个群集中只有线粒体基因上调。对cluster 9中的细胞也进行了类似的观察。这个群最有可能代表一个死亡或频临死亡的细胞群 此时再去除也可以。
另外一点,我们注意到,cellRanger3比cellRanger 2检测的MT(人的是MT开头的基因,其他物种主要找到相应的基因)高的细胞更多（umi拐点出现的更早）。原因主要是 cellRanger3或更高版本具有比版本2中的cell calling更敏感的算法,新算法基于EmptyDrops方法(Lun et al., 2018)。这种方法可以检测到之前版本算法所遗漏的细胞,特别是死亡或垂死的细胞,RNA含量自然较低的细胞,或异质性样本中的细胞。
image.png
这就也是为什么我们会主动地看看细胞中MT基因表达的原因,选择从下游分析中排除这些细胞。而在cellranger count管道中,没有直接的方法可以排除线粒体丰富的细胞 但是,您可以使用下面两种方法中的任何一种来间接完成此任务
image.png
下面的图显示，与其他细胞相比，Cluster1和Cluster19中的细胞的总UMI计数也很低。
image.png
当然我们最常用的还是Seurat。Seurat可用于筛选线粒体基因表达率高的细胞。
网友评论