CAGE-seq

[测序原理] CAGE-seq，加帽端mRNA测序，鉴定转录起始位点（TSS） - 知乎 (zhihu.com)

绝大多数基因有两个甚至两个以上的转录起始位点，不同的转录起始位点会导致基因受到不同的上游非翻译区的调控作用（5'UTR）。

为何要测量5端转录起始位点

不同的5'UTR序列中可能包含截然不同的作用元件，不同的起始位点导致了基因的表达所响应的信号也完全不同。同一个基因有可能受不同的启动子调控而导致表达的差异，可能会导致某些疾病的发生。

CAGE-seq

CAGE-seq (Cap Analysis of Gene Expression AND deep Sequencing) 可以对mRNA中所有的TSS进行鉴定，这是通过加帽位点鉴定实现的

什么是加帽？

在细胞核内的转录中，mRNA需要经历多种加工和修饰，包括剪接，5'端的加帽和3'端的加尾，以及碱基上的化学修饰等，才能变为成熟的mRNA，进入到细胞质进行翻译。

其中，加帽反应能够帮助细胞核的选择性孔道穿过，进入细胞质，还可以防止mRNA5'端的稳定性并增强翻译。

首先RNA三磷酸酶从前体mRNA的5'端移去一个磷酸，然后鸟苷酸转移酶在切除的末端加上一个鸟苷酸以形成5'-5'键；最后，甲基转移酶会对这个鸟苷酸进行甲基化修饰。

mRNA的帽子结构一定存在它的5'端，只要有办法鉴定这顶帽子，就能找到它的转录起始位点。

建库流程

CAGE - A highly sensitive and precise means of gene expression analysis. (cage-seq.com)

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• 在得到mRNA样品后，将mRNA序列碎片化为较短的小片段。
• 对所有片段去磷酸化，没有“帽子”保护的末端的磷酸集团将被磷酸酶移除，形成磷酸根离子和羟基。
• 使用脱帽酶将所有的“帽子”去除，只留下不受保护的5'端序列，但是因为没有被上一步使用的磷酸酶去磷酸化，没有羟基暴露出来。
• 链接接头，测序需要两种接头，其中一种接头被设计为链接有羟基暴露的磷酸，另一种则连接正常序列，因此只有原来受“帽子”保护的5'端序列才能同时结合两种接头，通过测序得到序列信息。

其他5端测序的方法

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Comprehensive comparative analysis of 5’ end RNA sequencing methods - PMC (nih.gov)