文献链接：The expanding vistas of spatial transcriptomics
发表期刊：Nature biotechnology
影响因子：68.164
发表时间：2022年10月
review：空间转录组测序技术（解读基础上，添加了截至2022年12月的商业化调研现状）
0. 文章背景
（1）空间转录组分析的三大意义：
- Tissue atlases：阐明组织的细胞类型组成
- cell-cel interactions：解释空间上细胞间的相互作用
- Molecular interactions：阐明组织中分子间的相互作用
（2）空间转录组技术的两大类别：
- Sequencing-based spatial transcriptomics（sST）：通过像素化的DNA条形码完整捕获组织切片中对应区域的RNA，并通过NGS测序读出基因表达和空间位置信息
- Imaging-based spatial transcriptomics（iST）：通过荧光原位杂交或直接的原位测序，以成像的方式记录空间信息，以荧光点的数目记录基因表达信息
图1. 空间转录组在生物实验中的应用
1. sST的相关方法和商业应用
1.1 sST的种类
sST 技术通常基于在反应载体表面构建空间索引（每个像素所代表的DNA序列即标志着其二维空间信息）。然后将组织被放置于带有空间索引表面的顶部，基于mRNA 3’端的polyA与空间索引oligo中polyT碱基互补配对的原理捕获，然后以逆转录的方式将空间索引标记到mRNA。
（1）Visium technology（10x genomics）
使用一个微阵列定位机器人，将一个独特的条形码传递到slide表面的一个固定的、已知的位置。这些spot的大小为50-200µm（尽管据报道即将推出的Visium产品将有更小的像素），并被类似数量的空白空间分隔，以防止在液体处理过程中混合。
商业链接：Spatial Gene Expression - 10x Genomics
（2）Slide-seq
使用固体微粒进行空间条形码编码。在slide-seq中，直径为10µm的beads被用作寡核苷酸链合成的固体载体，其中beads上条形码是通过split-pool cycles创建的，这也是最初为scRNA-seq创建细胞条形码开发的过程。
这些beads在slide上被制作成一个紧密排列的均匀单层，每个条形码的位置通过原位测序来确定。
商业链接：空间转录组测序迈进亚细胞时代
以上两种策略，都只能将像素大小缩小到1-5um的范围。但是可以通过原位扩增unique barcod 分子序列的方式（滚环扩增 or 桥式扩增）来得到较小的像素。
（3）Stereo-seq
在Stereo-seq中，DNA纳米球通过滚环扩增（RCA）获得，直径约200nm，中心距离约为 500-715nm，并对这些纳米球clony测序。然后将一段poly (T)捕获序列连接到条形码纳米球上，以实现捕获释放的RNA。
商业链接：时空组学技术Stereo-seq再次升级
（4）Seq-Scope
在Seq-Scope中，条形码是通过DNA随机序列直接通过局部桥式扩增嫁接到Ilumina的sequencing flow cell上的，可以创建0.5-1um的直径。
（5）DBiT-seq
2020年11月13日，耶鲁大学生物医学工程系樊荣团队在《Cell》上发表了一篇名为“High-Spatial-Resolution Multi-Omics Sequencing via Deterministic Barcoding in Tissue”的文章。该团队开发了一种可在组织中使用确定性条形码进行空间组测序(DBiT-seq)的方法，通过下一代测序(NGS)在甲醛固定的组织切片中共同绘制mRNA和蛋白定位。
DBiT-Seq的工作流程如下图所示，以甲醛固定的组织玻片为起始材料，将其与识别目标蛋白的抗体衍生DNA标签（ADT）混合物共孵育；随后使用带有50个平行微通道的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流体芯片放置在组织玻片上，以引入第一组DNA条码A溶液，其中每个条形码都带有一个连接接头和一个oligo-dT序列，用于结合mRNA或ADT的poly-A尾部；原位进行逆转录（RT）产生与条形码A1-A50共价连接的cDNA后移除该微流控芯片，再将具有与第一个芯片通道垂直的微流控芯片放置在组织载玻片上，以引入第二个DNA条形码，B1-B50，这些条形码包含连接接头、分子标识符（UMI）和PCR手柄；随后连接将条形码A和B，则生成二维数组的空间条形码AiBj（i = 1–50，j = 1–50）；接下来移除第二个PDMS芯片，保持组织完整并对目标mRNA和蛋白质进行空间条形码处理，带条形码的组织以可视化的单个像素进行光学成像；最后从组织中提取cDNA，并通过PCR扩增以通过标签化制备测序文库，使用配对末端NGS测序，从一端检测到空间条形码（AiBj），另一端检测相应的转录本和蛋白质条形码，再以计算方式重建空间表达图。通过对一组特定基因进行单分子荧光原位杂交（smFISH），以此验证DBiT-seq，发现DBiT-seq可检测到约15.5％的smFISH定义的总mRNA转录本，比Slide-seq高1-2个数量级。
工作流程示意图
1.2 sST平台的质量控制
重要参数：
- mRNA捕获灵敏度
- mRNA空间位置的准确性
- 适用性考虑：平台所能容纳的空间面积（以及组织样本形状、组分、大小的灵活适配）
由于细胞密度、细胞外基质组成、细胞RNAase含量以及其他特征的不同，组织单位面积内可捕获的RNA数量可以相差几个数量级（如图2）。常用的几种用于sST技术验证的组织材料：
- 小鼠嗅球： 嗅球由5个离散的层组成，每一层都有众所周知的分子标记
- 小鼠胚胎： 他们具有广泛的细胞组成异质性，而且比大脑中的细胞更小、紧凑；本文作者推荐12天-14天的小鼠胚胎，使用包括眼睛在内的外侧轴矢状切片，是一个具有清晰组织学层的对称结构，使得实验复制和方案之间的直接比较更加直接
关于sST方法的 转录本扩散评估，可以与smFISH染色产生的相同特征图像测量的相同尺寸进行比较
图2. sST方法和描述
2. iST的相关方法和商业化应用
iST中，RNA分子通过与荧光探针特异性杂交达到标记的目的，然后使用荧光显微镜对这些探针成像。尽管基于荧光的RNA原位检测已经被广泛应用了20多年，但光谱的限制阻碍了常规的5到10多个不同的有机荧光分子的同时成像。但是iST方法采用了多轮测序拍照的组合策略实现了转录本的检出。
因此，一种特定的iST方法在很大程度上是由检测方式、RNA分子如何标记和多路复用方法或如何在连续成像轮中检测多个RNA转录本来定义的。iST原位标记RNA分子主要有三种策略：（1）直接探针检测、（2）酶辅助探针检测和（3）直接RNA分子原位酶测序（图3a）。所有的检测方式都从固定的细胞和组织开始，其中RNA分子与细胞基质交联，从而在整个处理过程中固定它们的位置。
2.1 iST的种类
（1）直接探针检测（direct probe-based detection）
基于smFISH protocols，其中RNA转录本被许多（数量>20）短链（20-50个核苷酸）荧光标记的互补寡核苷酸探针招募到一个衍射受限点，产生点状高特异性信号。
（2）酶辅助探针检测（enzymatically assisted probe detection）
通过酶促检测和基于聚合酶的滚环扩增产生较高的检测灵敏度和特异性。与 direct probe-based detection相比，该方法有以下几个优点：
- 滚环扩增的产物在荧光显微镜中信号非常强，即使在较低的放大倍率和较长的曝光时间内，仍然具有较高的信噪比
- 逆转录酶的填充使得逆转录得到的转录本可以用于靶向位点的de novo测序，从而达到遗传变异（识别SNP位点）和mRNA标记定量的双重效果
- 增加的信噪比允许更多样化的迭代条形码方法，如商业荧光法的测序
商业应用1： http://www.dynamic-biosystems.com/content/?286.html
商业应用2： https://nanostring.com/products/cosmx-spatial-molecular-imager/cosmx-panels-assays/
商业应用3： https://www.instrument.com.cn/webinar/video_117136.html
（3）直接RNA分子原位酶测序（direct enzymatic sequencing）
该方法使用原位酶反应在组织细胞内进行RNA测序文库的构建。利用随机六聚体引物（random hexamer primers）进行原位逆转录生成cDNA，随后片段化并成环。这些成环的分子接着通过滚环扩增（RCA）的方式进行复制。在这里，对单个RNA分子的特异性是通过对RCA扩增子上展开的原位测序决定的。
由于它的非靶向性，该方法也是与sST非常相似。但是，由于RNA分子-->可测序的RCA分子的低转化率，限制了它在空间转录组实验领域的应用。
2.2 基于iST的多路复用方法
基于iST的多路复用主要有两类：顺序读出 和 组合多路复用。这两类技术都利用多轮成像来克服光谱带宽的限制。（图3a,b）
（1）顺序读出
在该方法中，一组独特的mRNA分子被标记和成像，并在每一轮成像中去除荧光探针。随后在下一轮成像中，标记一组新的mRNA，并重复这个过程。通过这种方式，独特mRNA靶点的数量是 （循环数 x 荧光通道数）。
优点：操作简单，不需要许多轮的成像和复杂的图像处理
缺点：重复成像的循环数对样本稳定性有影响，因此在多达100个target genes检测时需要权衡
（2）组合多路复用
在该方法中，每个mRNA分子在多轮成像的循环中被记录，它的身份标签通过有无成像以及其顺序来记录。例如，有学者为每个被记录的mRNA分子分配一个二进制代码，其中1对应mRNA分子的成像标记，0对应黑暗的成像标记，如此一来可以记录2的n次方种target genes（n表示成像循环数），同时实现了一个 hamming distance-corrected error-robust 密码体系，在密码体系的多样性中使用字节来实现在单次成像轮中检测和纠正错误。根据cycling chemistry的不同，该方式的实现也是多样的，最简单的循环化学是使用热/变性剂和/或DNAse的荧光标记探针在成像后去除DNA探针。不过，成像循环越多，通量则越低。
图3. iST方法学及其特征分析
2.3 成像数据分析
在收集多轮图像数据后，生成主要Spatial Transcriptomics数据将依赖于图像处理的三个主要步骤：
（1）spot检测、（2）图像配准和（3）解码为空间mRNA定位
细胞边界界定：可以通过荧光核染色（DAPI），经典的细胞表面maker或mRNA分子的自身定位划定细胞边界。
2.4 iST平台的质量控制
- iST中的敏感性和特异性：同样可以通过smFISH进行直接外部验证或内部设置阳性和阴性对照来评估。不过，这种iST方法的性能是否会随着 组合多路复用 的程度而变化的相关验证研究尚未公布。
随着被检测的mRNA数量的增加，分子拥挤可能会阻碍酶学方法的有效检测，并使基于FISH的检测的图像处理和解码变得困难。不过，在MERFISH和原位测序中，这种分子拥挤的情况已经通过expansion microscopy解决。
3. 研究展望
（1）适用于其他基因组问题
预计Spatial Transcriptomics 技术在量化转录组方面取得的进展将越来越多地应用于其他形式的组学检测。
- iST最近被用于通过靶向内含子来 量化新生mRNA
- 这种方法同样可以通过靶向外显子-外显子连接来 量化剪接变异。
- 这些技术也可以用于 研究表观基因组的修饰和调控
- 在 癌症突变分析中应用，基因组变异的空间分析可能有助于阐明体细胞突变与衰老和疾病的功能相关性。
- 蛋白质组亲和文库（包括抗体、纳米体和适配体）可以在原位使用和检测
（2）高分辨率解决各种生物学问题
- 获得构成组织的相关细胞网络，挖掘细胞间的相互作用
- 原位检测，精准定位细胞之间的功能性受体-配体相互作用网络
- 使用具有局部连接的原位PCR扩增来检测两个核酸之间的空间接近度
- 转录因子结合位点的定量
- 生物分子共定位
- 特定的细胞器隔室或间隙连接
（3）细胞动力学的观察
- 可以利用RNA的亚细胞定位来推断有关动力学的额外时间信息
- 空间信息可以在伪时间分析中提供背景事实
图4. ST技术在未来组学的应用
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