蛋白质晶体学基本原理和方法
1、什么是蛋白质晶体？
与其他有机或无机化合物晶体结构一样，蛋白质晶体结构是由相同的蛋白质分子或蛋白质分子复合物在空间中有序排列,从而构成的规则的3D阵列（如下图所示）。根据蛋白质晶体结构排列的对称性，晶体中的所有分子相对于晶格具有有限数量的独特取向。蛋白分子通过在晶格中的有序排列，将单个分子的衍射值叠加，最终获得足以测量的衍射强度，其中晶格起到放大器的作用。
通常，在晶格内蛋白发生小的构象变化，而不损坏晶体结构，并且在有些情况下晶格可以容许蛋白发生非常大的结构变化。因此，酶晶体通常具有催化活性。
小分子晶体和大分子晶体之间的一个显着差异，是后者具有的非常大的溶剂量。蛋白质晶体通常含有至少30％至高达80％（v/v）的溶剂。蛋白质中只有部分蛋白质表面参与晶体接触，其余的完全溶剂化，在溶液中的蛋白质类似。因此，蛋白质晶体非常柔软脆弱。但是，在晶体中蛋白质溶剂化程度较高具有积极的一面：如果蛋白结合位点不被晶体阻塞，则低分子量的配体、辅酶或底物可以通过原位结合的方式与蛋白结合，这些分子可以从周围的母液扩散到晶体内的溶剂通道中。
2、蛋白质结晶方法和技术
缓慢驱动浓缩的蛋白质溶液进入过饱和状态，在适当的条件下，蛋白质不会形成无定形沉淀，而是会沉淀在一个有序的晶体阵列中。为了降低蛋白的溶解度，使蛋白溶液达到过饱和状态，通过蒸发浓缩几乎饱和的蛋白质溶液，并加入对蛋白质具有强烈“盐析”作用的“沉淀剂”，例如聚乙二醇，或提高盐浓度，例如加入硫酸铵。蛋白质结晶的流程如下图所示。其他结晶技术已经开发出来，如油下结晶，琼脂糖凝胶中结晶，毛细管中使用自由界面扩散技术等等。
3、对已知靶点进行结晶
当已知结晶条件时，1 mg蛋白质可能足以产生具有不同抑制剂的一系列晶体。但是有一点往往需要注意，已发表的结晶方案往往难以复制。明智的做法是尽可能严格遵循公布的表达，纯化和结晶方案。应特别注意蛋白质构建体，因为对氨基酸序列的微小改变会对溶解度，稳定性和结晶效果产生显着影响。
4、解析新的蛋白质晶体结构
获得足够质量的晶体，尤其对新颖的、表征不佳的基因产物来说，通常是新结构测定项目中最困难也是最耗时的步骤。最近结晶机器人技术和提供众多商业结晶过滤器大大简化了工艺流程，缩短了建立大量结晶实验所需的时间，同时大大减少了所需材料的数量。现在，5-10 mg的均质蛋白质样品是足以筛选几百到几千个单独的结晶条件。然而，这通常不足以为困难的蛋白获得足量的晶体。
结晶的其他先决条件是良好的稳定性和足够的溶解度（通常为5-15 mg/ml，但一些高度可溶的蛋白质可能需要更高的浓度，而有的蛋白可以在1-5 mg/ml之间的浓度下结晶）。有时可以通过侧向诱变来提高溶解性和稳定性。随机诱变方法和合理方法都已被提出并成功使用。此外可考虑使用另一种物种代替人蛋白质。
通过缓冲添加剂或加入配体使蛋白质复合物形成，从而达到稳定蛋白质的目的，是增强可结晶性的有效方法。生物物理技术如热迁移（thermal-shift assay）测定和NMR可以用于发现合适的配体或添加剂。
翻译后修饰例如磷酸化可能是一个严重的问题，因为它们通常会导致严重的构象异质性。例如，蛋白激酶通常以无活性（未磷酸化）和活性（具有一种或多种磷酸化）物种的混合物的形式从真核表达宿主产生。一种可能的解决方法是将磷酸化位点突变为谷氨酸。带负电的谷氨酸侧链模拟磷酸化，从而产生具有组成性活性的激酶。
几种蛋白质构建体或突变蛋白质被开发，从而增加找到适合结晶蛋白的可能性。因此，分子生物学，蛋白质表达和生物化学方面的专业支持，对于成功的蛋白质晶体来说，绝对是必须的。此外，在工业环境中，应尽早开始这些蛋白质结晶的工作，以确保在开始化合物活性测定之前可以得到质量足够的晶体结构。
用于实验目的的重组蛋白，通常不适用于结晶实验。因为衍射良好的晶体需要蛋白质具有高度有序性。具有融合伴侣、标签过长、软性末端、松散连接的结构域，以及高度糖基化的蛋白通常不适合结晶。
糖基化蛋白质通常产生不良衍射晶体。为了避免这个问题，可以尝试几种策略：糖基化可以用PNGase F或其他糖苷内切酶酶切，糖基化位点可以突变，或者可以使用原核表达系统产生非糖基化形式的蛋白。
膜蛋白的结晶特别具有挑战性，超出了本文的讨论范围。然而，应该强调的是，许多跨膜蛋白的细胞内或细胞外结构域往往具有生物学功能或结合位点。这些可溶性结构域可以重组形式表达，并且通常可以进行结晶和结构测定。
当新的蛋白质靶标不能产生或结晶时，应考虑使用已知的同系物。如果结合位点足够相似，则可以破译一些关键化合物的结合模式，并可将此信息应用到药物设计过程中。
参考文献：Chapter 30 Protein Crystallography and Drug Discovery. InThe Practice of Medicinal Chemistry, 3rd Ed, 2008
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