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今天给大家介绍一篇基因组和转录组的文章。
首先看下，这篇文章的corrsponding author ：
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他来自威尔康奈尔医学院：
美国常青藤大学康奈尔大学旗下的威尔康奈尔医学院（Weill Connell Medicine, WCM）是美国顶尖医疗及教学机构及研究生教学机构，拥有包括纽约长老会医院在内的 40 家医疗机构。医院拥有四大优势专科，分别是器官移植、肿瘤、神经病学以及消化系统疾病科，对患者的转诊管理，多院区的体系建设，以及实现多家医院之间临床标准和操作模式的统一，处于世界最先进水平。
Abstract：
上尿路上皮癌（UTUC）具有侵袭的临床表型，为了定义这种表型的生物特性，我们做对UTUC做了综合的全外显子和RNA seq 测序。从我们的分子检测结果中，我们发现（1）大部分UTUCs是腔的乳头状。（2）UTUC 有一个T cell 衰竭的免疫微环境。 （3）高FGFR3表达在UTUC中富集，与T 细胞耗竭的肿瘤微环境相关；（4）散发性UTUC比膀胱尿路癌具有更低的mutational burden。我们的发现为深度理解UTUC生物学提供了一个基础，并且为UTUC-特异的治疗策略提供了基础。
Introduction
上尿路上皮癌（UTUC）占据了所有5-10%的尿路上皮癌，UTUC是一个侵袭行为的很强的的膀胱癌。最近TCGA把膀胱癌分成了5个分子亚型（(luminal-papillary, luminal-infiltrated, luminal, basal/squamous,
neuronal）由于TCGA 不包括UTUC，所以目前针对于UTUC的分子特征理解的不是很清楚，而且关于UTUC的免疫微环境的理解也不是很清楚的。
这些知识的空白限制了有效的UTUC特异的靶向治疗的发展。为了解决UTUC's 肿瘤和免疫细胞的生物特性，我们通过WES和RNA seq测序对高等级的UTUC肿瘤病人进行测序，这些病人数据来自3个不同的研究机构[Weill Cornell Medicine
(WCM), Baylor College of Medicine and MD Anderson
Cancer Center (BCM–MDACC)]。我们利用来自于TCGA的UCB肿瘤的全外显子和RNAseq数据作为一个比较的cohort。这就保证了我们去定义在起源于上尿和下尿的UC的生物学的差异，并深入了解驱动UTUC生物学意义的独特机制。 我们显示了UTUC是是光乳头状的以及T细胞耗竭。我们找出来了FGFR3是一个是UTUC的免疫微环境的假定的调控子，通过减弱IFNG信号。 最后，我们报道了零星的UTUC的TMB要比UCB低的，尽管DNA mismatch repair（MMR）的转录组表达比较低。
UTUC生物学
Result
UTUC and UCB mutational profiles
我们对37个UTUC 原发灶的肿瘤-正常组织对进行了WES。我们只包括那些具有高等级的UTUC的肿瘤。大部分病人是前任和现任的吸烟者。我们在37个病人中的11个找到了FGFR3突变。而这个突变在TCGA UCB数据中只存在13.7%（17/1 24). 与此相反的是与染色体修饰（KMT2D, ARID1A，KDM6A），酪氨酸激活酶 (PIK3CA,HRAS)，转录因子（RXRA，KLF5，ELF3），细胞循环调控（TP53，RB1，CNKN1A, CDKN2A)有关的基因在两个cohort之间没有差异。
为了定义shape UTUC基因组的突变机制， 我们做了突变signature 分析去找出广泛存在WCM UTUC，BCM-MDA UTUC，TCGA UCB 中的突变signature，我们在UTUC中找出了cosmic APOBEC相关的signature2和13，同时在C>T的转换在C
pG岛。这个signature和MMR有关。另外一个signature是NER（核酸内切修复）。总的来说，这些数据暗示了这三个突变过程（APOBEC,MMR,NER）对UTUC中大部分突变有责任。
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UTUC (WCM, BCM-MDA)和UCB (TCGA)。
Somatic down regulation of DNA damage repair(DDR) genes in UTUC
和DNA mismatch repair 有关的基因会引起微卫星不稳定（MSI）以及lynch 并发症。以及增长的引起UTUC的可能性。 然而还是不清楚是否non-lynch的UTUC 病人具有损失的DDR和增长的突变载荷。为了定义是否DDR基因的失控是否在non-lynch病人的超突变的表型中具有相似的角色。 我们评价了DDR pathway基因的mRNA的表达在UTUC和UCB中，我们找出参与到DDR pathways（mismatch repair基因，碱基剪切修复，NER，同源重组等）比较UTUC和UCB的差异。 我们发现了一个显著的35个癌症有关DDR基因的失活在UTUC中。我们分析了geminle WES 数据来自于我们UTUC corhorts数据然后找到在致癌的MMR基因没有germinle 突变。有趣的是，我们在UTUC中发现显著的低的致癌MMR基因（MLH1，MSH2，MSH6）的表达。为了决定这种降低的mRNA水平是否更进一步表达低的MMR蛋白，我们用免疫组化去找在WCM UTUC肿瘤中去看他们的表达相比较WCM UCB肿瘤，我们发现MLH1,PMS2,MSH2，MSH6蛋白质的水平在UTUC中显著较低。这就说明了这些蛋白的低表达是UTUC的一个特征，尽管在WCM UTUC中缺少germline 和somatic 突变。
为了决定是否这些蛋白质的下调会减弱DNA MMR。我们检验了WES data 中的MSI用MSI sensor 程序去计算在UTUC和UCB中微卫星不稳定的百分比，令人惊奇的是，这个MSI sensor的中值在WCM UTUC和 TCGA UCB中是相似的，两个都低于以前定义的阈值3.5，这个3.5是微卫星不稳定的准确的分类。 而且，WCM UTUC样本具有更低的平均的突变载荷（TMB）相比较TCGA的UCB肿瘤（2.91 vs 5.46 突变每MB）。 这就暗示了MMR蛋白表达量的下调对导致产生MSI是无效的，并不是主要的致癌因素的驱动者在non-Lynch UTUC。总的来说，这些发现证实了mRNA和MMR基因的蛋白质水平的降低在UTUC中并不会转化成MSI和更高的TMB。
UTUCs are predominantly luminal-papillary
为了找出可以定义UTUC的基因表达谱特征，我们从32个UTUC 肿瘤和TCGA UCB corhort 里面得到了一个RNAseq meta 数据集。 为了保证异质性，我们做了对数据进行了过滤。我们同时比较了40个持家基因来自于WCM UTUC， BCM-MDA UTUC和TCGA UCB，发现大部分基因没有显著的差异。
用来自于North carolina university的47个基因 signature分类， 我们发现27/32 (84/3%) 个UTUC 肿瘤和luminal subtype 聚类到一起，而59/128(46.1%) 在UCB中，为了保证luminal 表达pattern是UTUC中持续的生物特性，我们用几种方法证实了这种发现。首先，我们用两种额外的 尿路上皮癌的classifiers 亚型去整合同样的meta 数据集。 当我们利用这个MDACC 分类，这里把UC分成luminal，basal和p-53 like的亚型，我们发现22/32(68.7%)的UTUC肿瘤被聚类到luminal 亚型，而UCB中只有47/128(36.7%) 聚类到luminal 亚型。 利用最近的TCGA数据集分类把UC分成了luminal-papillary，luminal-infiltrated，luminal，basal-squamous 和neuronal 亚型，我们证实UTUC有一个luminal-papillary 表型（20/32,62.5%），大部分剩余的UTUC肿瘤显示了luminal表达文件（8/12,67%）。这个结果于TCGA UCB corhort 中 35/128 (27.3%) 有luminal-apillary UCB肿瘤相反，剩余的只有一小部分和luminal或者luminal-infiltrated 亚型聚集在一起。 为了证实这些发现，我们用了一个不同的方法，我们用非负矩阵分析（NMF），一个敏感的无监督统计方法去分解以及提取UTUC的关键的生物学特性从我们高维的RNA seq数据集中，这个NMF分析揭示了3个主要成分，luminal/carcinoma in situ (CIS)-low, basal/squamous-like, 和 extracellular matrix (ECM)/epithelial–mesenchymal transition (EMT) 相关的数据集。主成分分析(PCA)对NMF得到的系数进行分析，以可视化三组分分离(图3b)。这证明了荧光-乳头状成分是UTUC。我们的结果表明，大多数UTUCs代表
UC分化连续体中的一个独特子集，与发光-乳头状亚型具有相似的特征。
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UTUC has a T-cell depleted immune contexture
免疫肿瘤环境是宿主肿瘤抗癌免疫反应和临床表现的的基本决定因素。 为了检测UTUC的基因表达文件，这个文件可以代表样本的免疫微环境，我们找到了170个包含了关键免疫基因的列表。这个列表有分类，将肿瘤分类成T细胞发炎和T细胞耗竭两个clusters。 更有趣的是，大部分UTUC肿瘤（WCM，BCM-MDA）都是T细胞耗竭的，伴随一些T细胞相关的基因的下调（CD8A，CCL2，CCL3,CCL4,CXCL9,CXCL10）和IFNG信号基因的下调。 但是TCGA的UCB大部分是免疫炎症的。
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FGFR3 is a putative driver of UTUC’s immune-depleted contexture
为了找出可以代表UTUC的免疫微环境的信号通路，我们做了基因表达分析去检测outliers。我们在14/32个病人里面检测出异常值 FGFR3 mRNA的表达在我们的UTUC corhorts中。这些发现暗示了激活的FGFR3信号在UTUC中起着重要的作用，在关于UTUC的基因表达图谱中，我们去评价是否FGFR3在T细胞发炎和T细胞耗竭的肿瘤中是否有差异。确实我们在T细胞耗竭的种群里面发现了更高的FGFR3的表达。我们整合了FGFR3信号通路和T细胞耗竭表型之间的功能联系。我们重新分析了一个以前发表的来自于RT-112 UC细胞系的mRNA的数据集，这个数据集敲掉了FGFR3。我们发现了几个IFNG反应的基因包括（BST2 ， MX2，IRF9，GBP2）在FGFR3敲掉后，表达量上调。为了证实这个结果，我们发现BST2和IRF9在T细胞耗竭的种群里显著下调。为了确认观察并确定是否有药物抑制作用FGFR3对IFNG反应基因也有类似的影响 。 我们测试了erdafitinib，一种小分子FGFR3抑制剂，在三种不同的UC细胞系中的作用(RT-112, RT-4和SW780)。这些细胞系含有FGFR3融合(rt - 112, RT-4: FGFR3-TACC3;SW780 FGFR3-BAIAP2L1):导致组成性激活FGFR3信号。我们发现erdafitinib的治疗导致BST2显著的上调，BST2是干扰素信号激活的标志(图4f)。总的来说，这些发现表明FGFR3起着重要的作用在UTUC中塑造t细胞枯竭表型的作用以癌症细胞自治的方式。
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Discussion
我们进行了全面的基因组和转录组研究去分析UTUC，确定关键的生物学特征去区分UTUC和UCB。我们发现大多数UTUC肿瘤呈发光乳头状，t细胞减少。
先前的研究证实了林奇综合症之间的联系由MMR基因的生殖系突变和UTUC引起的。然而，绝大多数UTUCs是零星出现的(非lynch综合征患者)。我们的分析旨在定义UTUC患者是否有MSI或更高TMB是免疫应答的独立预测因子检查点抑制。我们的研究显示TMB较低，在非lynch UTUC中与UCB的比较。我们发现典型MMR mRNA和蛋白的低表达在非lynch UTUC中不足以产生显著的MSI或高于UCB的TMB。不像完全没有MSH2 MLH1、MSH6或PMS2或MLH1蛋白表达，Lynch综合征患者功能突变，这些蛋白质的完全丢失在偶发性UTUC中观察到的并不足以引起MSI。甚至低MMR蛋白表达足以维持功能MMR和保持微卫星稳定。这些结果也与最近的研究显示MSI传感器一致大多数非lynch综合征UTUC得分< 3.5。综上所述，我们的研究结果表明，与流行的观点是，散发的UTUC不是超突变的。这与我们的数据显示，大部分的偶发性UTUCs也是荧光乳头状细胞和t细胞持续减少。这个了解突变景观和免疫环境在非林奇综合征中，UTUCs(构成
大多数病例)进一步解释了缺乏较高反应免疫临床试验中UTUC与UCB的比较检查点抑制剂。在一项前瞻性的2期研究中晚期、铂后UC患者(包括UTUC) atezolizumab的应答率最低luminal-乳头状细胞(cluster I)亚型与其他亚型的比较。在另一项试验中，对尼鲁单抗的反应较低IFNG低表达的luminal 1 (cluster I) UC肿瘤 signature genes。
我们确定了FGFR3上调在UTUC中可能发挥的作用塑造t细胞减少的UTUC的免疫环境肿瘤。这个观察结果与先前的一致描述了在luminal中FGFR3基因标记的富集UCB肿瘤s2 - 6,25和FGFR上调与胰腺和乳腺肿瘤中的t细胞缺失起源于。我们观察到BST2在药物治疗后持续升高三种不同UC细胞系中的FGFR3抑制激活FGFR3融合。BST2是一种病毒限制因子是由干扰素诱导的。这也是符合的FGFR3在阻断Y701酪氨酸磷酸化中的作用STAT1激活所需。综合来看，这些发现提供了FGFR3和IFNG之间假定的机制联系这表明FGFR3抑制可能会重塑通过上调干扰素表达UTUC的免疫环境反应基因来逆转t细胞枯竭的表型。我们的观察也为合并提供了理论依据FGFR3抑制剂与PD-1/PD-L1抑制剂作为靶向调节t细胞减少表型的治疗策略UTUC。两种泛fgfr的初步临床试验结果erdafitinib和BGJ398在几种癌症中富集包括尿路上皮癌在内的FGFR基因组改变。Erdafitinib被批准加速批准FDA对复发/难治性转移性膀胱癌的研究根据2期临床试验结果显示应答率为32.2%87例肿瘤患者体内存在可激活的FGFR。我们的研究结果表明，FGFR3的临床试验抑制剂作为单一药物或联合免疫检查点封锁作为一种靶向utu的治疗策略
必要的。这一策略也可能适用于其他公司具有fgfr3激活分子改变的肿瘤类型。我们的研究有多种优势。我们使用了不同的方法
以证实以荧光乳头状为主的表型UTUC的生物学特征是一致的。在之前的研究，对两种高等级RNAseq数据进行无监督聚类低等级的UTUC被用来将UTUC分为四种分子亚型。这里，我们使用了另一种方法在UC生物学连续体中定位高级UTUC我们的研究也有一些局限性。即使我们包括来自三个主要学术机构的患者，我们的队列仍然是由于这种肿瘤类型相对罕见，样本量有限。在更大的UTUC队列中进一步证实了我们的发现是必要的。
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