Cell Ranger 软件是 10X genomics 官方提供的配套分析软件，相信使用过 10X genomics 平台进行单细胞转录组测序数据分析的老师们对它一定不陌生，但该软件在进行比对定量时究竟遵循什么样的原则？它是如何识别高质量细胞的？产生的结果各部分如何解读？在这里，我们将使用三篇文章的时间，为大家一一解惑~
Cell Ranger 是什么？
Cell Ranger 是 10X genomics 官方提供的一套针对单细胞 RNA 测序输出结果进行比对、定量、聚类及基因表达分析的分析流程，它包含有与单细胞基因表达分析相关的四个pipelines，分别是：
cellranger mkfastq 流程：其功能为将 Illumina 测序仪产生的 raw base call (BCL) 文件解析成 FASTQ 文件。
cellranger count 流程：其功能为将 cellranger mkfastq 产生的或其他来源的 FASTQ 文件进行比对、过滤、barcode 计数以及 UMI 计数，并可以生成 feature-barcode 定量矩阵，随后确定细胞群并进行基因表达分析。
cellranger aggr 流程：其功能为将多个 cellranger count 产生的数据进行整合、标准化，并可以对整合后的数据进行分析。
cellranger reanalyze 流程：其功能为使用 cellranger count 或 cellranger aggr 产生的表达矩阵重新进行降维、聚类等后续分析。
以上四个pipeline 均将转录组常用比对软件 STAR 封装其中，可以输出带有细胞信息的 BAM、MEX、CSV、HDF5 及 HTML 等格式的结果。
下面，我们着重介绍其进行基因比对的理论模型。
Reads 的修剪
针对 3’ 建库数据的基因表达比对，在比对之前会先对 reads 进行修剪。
cDNA 的全长结构中，在 3’ 和 5’ 端分别带有 poly-A 尾和TSO 序列结构（相对于比较长的 RNA 分子，一部分来自短 RNA 分子的 reads 可能仅包含 TSO 和 poly-A 序列的其中一种）。由于这种低复杂度的非模板序列的存在有可能混淆 reads 的映射，所以在比对之前一般会将 poly-A 尾和 TSO 序列分别从 reads 的 3’ 端和 5’ 端切除，这一步骤有助于提高分析的灵敏度和软件分析的效率。
如何判断 reads 比对到了基因组？
Cell Ranger 中封装了比对软件 STAR，根据转录本的注释文件 GTF 中的注释信息，使用 STAR 来判断reads 是比对到了外显子、内含子还是基因间区上，或者说来判断 reads 是否比对到了基因组上。
当一条 read 至少要有 50% 碱基序列与基因组上的外显子碱基互补配对，认为其比对到了外显子上；若 reads 未比对上外显子但与内含子相交，则认为其比对到了内含子上；否则为比对到了基因间区。若 reads 比对到了一个单一的外显子位点，但同时比对到了一个或多个非外显子位点，则优先认为该 read 比对到了外显子位点，MAPQ 为 255。
如何判断 reads 比对到了转录本？
Cell Ranger 通过检测 reads 比对上的外显子和内含子与转录本的相容性，进一步将 reads 与注释的转录本对齐。如下图所示，reads 根据它们是正义还是反义，以及它们是外显子还是内含子，或者它们的剪接模式是否与该基因相关的转录本注释兼容来分类。
图片
上图中，绿色展示的是基因及基因中所包含的外显子，Transcript 1 和 Transcript 2 为基因经过可变剪切形成的两种转录本所包含的外显子。针对比对到正义链上的reads，如果 reads 比对到了一个外显子上或者比对到两个相邻的外显子上，则该 read 被分类为转录本 read（蓝色）；如果 reads 比对到两个不相邻的外显子上，则该 read 被分类为外显子 read（浅蓝色）；如果 reads 比对到内含子区域，则该 read 被分类为内含子 read（红色）；紫色表示 reads 比对到反义链上。
小知识（敲黑板）
在默认情况下，只有蓝色的转录本 read 会被计入到 UMI 计数中。但在某些情况下，如在实验时输入的为细胞核时，未剪接的转录本有可能产生高水平的内含子序列，为了将这些内含子 read 计入，cellranger count 可以添加一个参数为 include-introns。当使用该参数时，任何比对到单个基因的 reads ---- 包括转录本 read（蓝色）、外显子 read（浅蓝色）和内含子 read（红色）都会计入 UMI 计数中。
此外，只有在基因组上有唯一比对位点的 reads 才被计入到UMI计数中。
如何进行 UMI 计数？
1. 在计算 UMIs 之前，Cell Ranger 会试图矫正 UMI 序列中的测序错误。
- 在转录本上有唯一比对位点的 reads 根据他们的barcode、UMI 和比对到的基因被分成不同的组。如果两个组的 reads 拥有相同的 barcode 序列并比对到同一个基因上，但是 UMI 序列中有一个碱基不同，那么其中一个 UMI 有可能是因为测序中的碱基替换错误而引入的。在这种情况下，UMI 的reads 数量少的那一组会被更正为 UMI 的reads数量多的那组。
2. 矫正可能的测序错误后进行 UMI 计数。
- Cell Ranger 会再次按照 UMI（可能是修正后的）、barcode 和比对到的基因对 reads 进行分组。如果两组或者多组的 reads 拥有相同的 barcods 和 UMI 序列，但是比对到了不同的基因上，那么 reads 计数最高的那组比对到的基因会被进行 UMI 计数，其他的组则被舍弃掉。如果 reads 最高计数相同，则全部的组都被舍弃掉。
经过这两步过滤步骤后，每一个被统计到的barcode、UMI 和 基因都会被保存在未过滤的 feature-barcode 矩阵中，输出在 unfiltered feature-barcode matrix 文件夹中。
图片
好啦，以上就是本篇的全部内容，在下篇文章中我们会重点介绍 Cell Ranger 如何判断识别高质量细胞，欲知后事如何，且听下回分解~
网友评论