2022年1月，来自华中科技大学同济医学院的程翔团队在 Advanced Science 杂志上合作发表了题名为“Aorta Regulatory T Cells with a Tissue-Specific Phenotype and Function Promote Tissue Repair through Tff1 in Abdominal Aortic Aneurysms”的研究论文，该研究利用单细胞测序、单细胞免疫组库检测、bulk RNA-seq 等技术，在腹主动脉瘤模型中发现了一群特殊的主动脉 Treg 细胞，其在腹主动脉瘤发展进程中逐渐增加，并显示出独特的分子表型和组织特异性。后续小鼠敲除模型的研究结果则提示，该主动脉 Treg 分泌 Tff1 来调节平滑肌细胞（SMC）的凋亡，而体外实验则表明 Tff1 通过细胞外信号调节激酶1/2通路（ERK 1/2 pathway）抑制 SMC 凋亡。这一发现揭示了主动脉 Treg 的组织特异性表型和功能，可能为预防腹主动脉瘤发展提供一个新方向。该研究中单细胞转录组测序、免疫组库测序服务由博奥晶典提供。
【发表期刊】Advanced Science
【发布时间】2022年1月
【影响因子】16.807
【检测技术】单细胞测序、单细胞免疫组库检测、bulk RNA-seq
科学问题
腹主动脉瘤（AAA）的发病机制目前还不完全清楚。既往研究表明，慢性炎症在 AAA 发展进程中起重要作用。AAA 的局部出现是慢性不可控炎症的结果，深入了解局部炎症反应，对于打破这种恶性循环，甚至找到新的治疗靶点至关重要。
调节性 T 细胞（Treg，定义为 CD4+Foxp3+）是一种特殊的 T 细胞亚型，在调节炎症反应和维持免疫稳态中发挥重要的作用。既往研究提示，Treg 参与了动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死的调节。有研究表明， Treg 参与了 AAA 慢性炎症的调节，可能是 AAA 治疗的潜在靶点。然而，到目前为止，Treg 在 AAA 发展中的调控作用还没有完全了解。
研究思路
研究技术路线
主要研究结果
1、在 AAA 发展进程中，高比例 Treg 细胞浸润主动脉
此前已有研究表明，Treg 细胞在血管紧张素II诱导的 AAA 中发挥保护作用。所以研究者采用猪胰腺弹性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）诱导的 AAA 模型，通过流式细胞仪分析腹主动脉中 Treg 细胞的动态变化（图1 a），发现在 AAA 发展进程中，主动脉内 Treg 细胞比例逐渐扩大，术后 14 天达到峰值，28 天保持升高（图1 b、c）。相比之下，Treg 在脾脏中几乎没有变化（图1 b、c）。而主动脉 CD4+T 细胞和炎症细胞的数量均在 AAA 后第 7 天达到高峰，之后下降，这意味着局部炎症反应得到了控制，可能是因为 Treg 细胞数量的增多。
随后研究者通过功能缺失和获得实验来评估 Treg 在 AAA 模型中的作用，结果发现 Treg 缺失后，显著增加了主动脉瘤的直径，而通过 IL-2 的复合治疗后则增加了 Treg 细胞，降低了主动脉瘤的直径。
结果表明，Treg 在 PPE 诱导的 AAA 发展进程中具有重要的保护作用。
图1 Treg 在 AAA 模型的主动脉内聚积
2、主动脉 Treg 转录图谱显示出独特的表型
随后对 Treg 进行了 bulk RNA-seq，以研究主动脉 Treg 与脾脏、淋巴结等器官的 Treg 的组织特异性表型。数据分析（主成分分析、组间差异分析等）发现，AAA 小鼠的主动脉 Treg 与其它类型的组织 Treg 有显著差异（图2 a、b）。尽管显示出不同的基因表达谱，但主动脉 Treg 仍然是明显的 Treg 细胞，表达多个 Treg 特征基因，如高表达 Foxp3、Cd25、Tff1 等，低表达 Tcf7、Lef1 和 Tgfbr2 等（图2 d、e）。功能富集分析则发现主动脉 Treg 不再仅仅发挥免疫调节作用，它们在 AAA 发展进程中还参与调节细胞外基质的功能（图2 f、g）。
这些结果都提示主动脉 Treg 是一种新的组织 Treg ，与传统的淋巴 Treg 不同，并具有与组织微环境相关的特定功能。
图2 主动脉 Treg 的独特表型
3、主动脉 Treg 显示出克隆扩张并具有独特的 TCR 克隆
研究者通过流式细胞术表明 AAA 模型中的 Treg 呈现增殖表型（图3 a）。随后对 AAA 小鼠主动脉和相应脾脏的 CD4+ 细胞进行了单细胞 RNA-seq 测序，并结合免疫组库 TCR 测序，最终获得了 41341 个细胞，识别出 17 个亚群，确定了四个 Treg 亚群（图3 b、c）。根据组织分布，研究者分析了脾脏和主动脉 Treg 的 TCR 克隆情况，与其他组织 Treg 相似，主动脉 Treg 具有独特的 TCR 克隆表型，只有少数主动脉 Treg 的 TCR克隆与脾脏 Treg 或主动脉常规 T 细胞（Tconvs，定义为 CD4+Foxp3– cell）相同（图3 d），而根据 Ki67 染色结果，主动脉 Treg 克隆扩张比例明显高于脾脏（图3 e）。这些结果都显示在 AAA 中的主动脉 Treg 以克隆扩张为标志。
图3 主动脉 Treg 具有独特的 TCR 克隆扩张
4、在 AAA 发展进程中增加的 Treg 主要来自外周募集
接下来，文章继续探索 AAA 中 Treg 的来源问题。首先使用 FTY720，S1P1 受体激动剂防止 T 细胞从淋巴器官再循环到外周部位，结果发现，主动脉 Treg 的比例和数量明显减少。接下来，使用转基因小鼠来跟踪 AAA 中 Treg 和 Tconvs 的迁移（图4 a），在 ALN（Axillary lymph node）、PALN（Para-abdominal aortic lymph node）和主动脉瘤中检测到一组 Kikume-red+ Treg 和 Tconvs （图4 b、c）。当校正总体循环模式时，可以清楚地看出 Treg 和 Tconvs 之间的主要差异，是由于 Treg 迁移到受伤的主动脉所造成的（图4 d）。随后，文章使用异种共生实验来确定外周血 Treg 对主动脉 Treg 细胞群体的贡献程度（图4 e），基于数据结果，研究者估计，在 AAA 进展期间，募集的 Treg 约占扩大的 Treg 群体的 78%（图4 e）。最后研究者根据转移实验以及 TCR 的相似性结果，表明 AAA 中的 Treg 是外周诱导的 Treg 细胞（peripherally induced Treg，pTreg），由外周组织转化的 Tconvs 衍生而来。
图4 AAA 发展进程所增加的 Treg 细胞主要来源于外围募集5、IL-33/ST2 信号轴参与主动脉 Treg 细胞的维持
前期研究发现，IL-33 和 ST2 在动脉瘤中的表达增加，且 IL-33 主要来源于成纤维细胞。因此，文章进一步探讨 ST2 在主动脉瘤的主动脉 Treg 上的表达，并通过增强或阻断 IL-33/ST2 信号通路来观察 IL-33/ST2 信号轴在主动脉 Treg 上的作用。在 ST2 缺陷小鼠中，损伤主动脉中的 Treg 数量减少（图4 f），相比之下，在 AAA WT 小鼠中，外源性给予 IL-33 后，主动脉 Treg 细胞增多，ST2 表达升高（图4 g）。
综上所述，这些数据提示 IL-33/ST2 信号轴参与了主动脉 Treg 的维持。
6、类似的 Treg 亚群扩张出现在 CaPO4 诱导的 AAA 模型
为了证实主动脉 Treg 是否广泛存在，文章用 CaPO4 诱导的 AAA 模型来评估主动脉 Treg 的作用。在该诱导模型中，发现类似的 Treg 群体在主动脉瘤中积累的现象，并表现出高增殖状态（图5 a、b）。随后，文章测试了 CaPO4 诱导模型中 Treg 是否也与 PPE 模型中的 Treg 有相同的来源，结果发现使用 FTY720 可以阻断 AAA 中 Treg 的增加（图5 c），该观察结果表明，外周循环中的 Treg 池对主动脉瘤中的 Treg 数量贡献很大。此外，在该模型中检测了主动脉 Treg 上 Helios 和 Nrp-1 的高表达（图5 d），提示这是胸腺起源。
接下来测试了 IL-33/ST2 信号轴是否也参与了 CaPO4 诱导的 AAA 中主动脉 Treg 的维持，与脾脏 Treg 相比，主动脉 Treg 高表达了 ST2（图5 e）。在 ST2 缺陷小鼠中，主动脉 Treg 显著的减少（图5 f），而脾脏 Treg 未发生变化（图5 g）。重组 IL-33 可以增强 AAA WT 小鼠主动脉中 Treg 的增殖，也增强了 ST2 的表达（图5 h）。
这些结果表明，IL-33/ST2 信号轴对 CaPO4 诱导的 AAA 模型中主动脉 Treg 的维持是至关重要的，同时也表明，主动脉 Treg 作为一种独特的群体存在于主动脉瘤中，不依赖于特定的 AAA 模型。
图5 在 CaPO4 诱导的 AAA 模型中，出现类似的 Treg 亚群扩张
7、主动脉 Treg 优先表达 Tff1，抑制 SMC 凋亡，减弱腹主动脉瘤
紧接着，文章分析了主动脉 Treg 的转录组数据，发现胃肠道保护和修复的关键肽 Tff1 是主动脉 Treg 与淋巴器官 Treg 的差异表达最高的基因之一（图6 a）。为了证实 Tff1 在主动脉 Treg 上的表达，文章使用了 RT-PCR 检测、GEO 公共单细胞数据分析、免疫荧光检测等方法（图6 b），都表明 Tff1 在主动脉瘤中由 Treg 产生，可能是一种组织特异性。
之前的研究表明，Tff1 可以抑制平滑肌细胞的凋亡（smooth muscle cell，SMC）是 AAA 最重要的致病机制之一，因此，文章推测 Treg 产生的 Tff1 在 AAA 中具有抗凋亡作用。为了阐明 Treg 衍生的 Tff1 在 AAA 中的作用，并确定其是否影响 SMC 的凋亡，文章使用 Tff1 等位基因（Tff1flox/flox）的小鼠与 Foxp3-cre 小鼠杂交，特异性地消除 Tff1 在 Treg 中的表达（图6 c），而 Tff1 在小鼠胃中的表达则不受影响（图6 d）。随后使用 PPE 诱导 Foxp3cre/creTff1flox/flox 小鼠的 AAA，结果发现，选择性敲除 Tff1 后，主动脉 Treg 的保护作用减弱，动脉瘤直径增大（图6 e），血管壁介质中弹性蛋白广泛降解（图6 f）， SMC 的凋亡增加（图6 g），假手术组则无明显差异（图6 e、g）。随后，使用 Treg 过继转移实验来进一步支持该结论，即 Treg 表达的 Tff1 在 AAA 的保护中发挥重要作用。最后使用腺病毒过表达系统来评估 Tff1 在 AAA 中的治疗作用，结果如预期，Tff1 处理对AAA 具有保护作用（图6 h、i）。
综上所述，这些结果提示 Tff1 可能具有潜在的临床转化价值。
图6 Treg 产生的 Tff1 可调控 AAA 中 SMC 细胞的凋亡
8、Tff1 通过激活 ERK1/2 抑制 SMC 凋亡信号通路
接下来文章进一步研究 Tff1 是否在体外对小鼠原代血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）有直接作用。在培养的 VSMC 中，Tff1 以浓度和孵育时间依赖性的方式减弱 VSMC 的凋亡（图7 a）。根据前期报道，细胞外信号调节激酶 1/2 通路（ERK 1/2 pathway），AKT 和 NF - B 信号通路在 SMC 生存方面发挥了重要作用，因此研究者推测 Tff1 通过 ERK1/2 信号通路抑制 VSMC 凋亡。通过 Western Blotting，发现 Tff1 组中显著提高了 VSMC 中磷酸化 ERK1/2 （pERK1/2）的蛋白水平（图7 b、c），而细胞凋亡的关键因子 procaspase-9 在 Tff1 组中则出现显著的表达降低，procaspase-8 水平则无变化（图7 b、c）。
为了进一步证实 ERK1/2 通路在 Tff1 介导的 VSMC 存活中的作用，在 Tff1 存在的情况下，对 VSMC 进行 ERK1/2 抑制剂（SCH772984）或不使用 ERK1/2 抑制剂的处理。结果表明，Tff1 显著增加了 ERK1/2 的磷酸化，降低了凋亡的关键因子的比值，而 ERK1/2 抑制剂可以显著逆转了这些变化（图7 d、e），通过流式细胞术也表明 ERK1/2 抑制剂可以显著增加 VSMC 凋亡，并消除 Tff1 的保护作用（图7 f）。因此，结果表明 Tff1 通过激活 ERK1/2 信号通路抑制 VSMC 的内在凋亡。
图7 Tff1 通过激活 ERK1/2 通路抑制 SMC 凋亡总结
越来越多的文献表明，Treg 代表了一种高度复杂和异质性的淋巴细胞谱系，在其驻留的组织中具有特殊的功能。在这里，文章报道了一组独特的小鼠 AAA 病变特异性的 Treg 细胞，它具有独特的分子表型和 TCR 克隆表型，并在维持血管组织稳态方面发挥了重要作用，超出了在 AAA 中抑制炎症的既定作用。研究结果发现，在 AAA 进展期间，Treg 对血管结构和功能完整性的保护能力是通过 Tff1 基因激活 ERK1/2 信号通路从而抑制 SMC 凋亡来实现的。
参考文献：
Li J, Xia N, Li D, et al. Aorta Regulatory T Cells with a Tissue‐Specific Phenotype and Function Promote Tissue Repair through Tff1 in Abdominal Aortic Aneurysms. Advanced Science, 2022: 2104338.
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