2019-01-20

使用细胞热移位测定法鉴定嘌呤核苷磷酸化酶作为奎宁的靶标

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文献导读

细胞热转变分析实验（CETSA）最初是为了帮助抗癌药物靶向研究而开发出来的方法，它是第一种广泛应用无标签方法来研究药物靶向完整细胞的方法。
这项技术是根据热展开蛋白在细胞中迅速沉淀后通过监测heat challenge后剩余的可溶性蛋白来测量融化曲线的。这与使用纯化蛋白的经典热转移实验类似，配体结合通常导致蛋白稳定和熔融温度（tm）的正向转移。将CETSA与多路定量质谱连用（MS-CETSA）可以同时监测整个蛋白组在药物治疗过程中蛋白质热稳定性的变化。这样就可以在MS-CETSA中识别与药物互相作用的蛋白质，而不需要事先了解相关的通路或机制，在这项研究中，作者为用MS-CETSA来研究恶性疟原虫开发了一种有效的方法，并且将其应用于抗疟药物靶点的识别上。随后，作者用这种方法鉴定出恶性疟原虫嘌呤核苷磷酸化酶（PfPNP）为奎宁和甲氟喹的蛋白靶点。作者还运用了酶学和生物物理的体外实验，观察到了奎宁和PfPNP的高亲和力。得出了其起药物的MoAs中的作用。

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文献摘要

对于临床上使用的大多数抗疟药物，我们对其机制（MoAs）一直难以捉摸。为了减少对抗疟治疗的反应性，我们有必要去更好的理解他们的作用机理（MoAs）和相关耐药性机制。在本研究中，作者采用的细胞热转变分析（CETSA）结合质谱法（MS）对人疟疾的主要致病原恶性疟原虫进行了药物靶向鉴定。验证结果是该方法对叶酸拮抗性乙胺嘧啶和广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64d的有效性。随后，作者将MS-CETSA应用于两种重要的抗疟药物奎宁和甲氟喹，发现这两种药物的MoAs特征不明显。之后作者又结合了对P恶性疟原虫裂溶液和完整感染红细胞的研究，发现P恶性疟原虫嘌呤核苷磷酸化酶（PfPNP)是这两种 这两种喹啉类药物的共同结合靶点。之后作者再一次利用重组蛋白进行了生物物理和结构相关研究，证实了这两种化合物都结合在酶的活性位点上。由于奎宁与PfPNP具有较低的纳米分子亲和力；因此其治疗效果很明显。总之，作者证明了对恶性疟原虫实施MS-CETSA是阐明现有的和潜在抗疟药物的MoAs的一项有希望的方法。

文献背景

疟疾是由热带和亚热带地区疟原虫属原生生物引起的流行传播疾病。在过去的十年中大家通过持续不断的努力去根除疟疾使得全球负担和死亡率大大的减少了。然而, 疟疾仍然是一个重大的健康问题，根据世界卫生组织的估计，仅在2016年便有2.16亿疟疾患者和44500例死亡患者。最近在疟疾控制方面取得的成功主要是有效的控制了媒介和采用了青蒿素联合疗法。然而，蚊子对常用杀虫剂的耐药性的增加和疟原虫对标准ACTs的反应性降低可能会使疟疾发病率在不久的将来大幅度的升高。
绝大多数用于临床上的抗疟药物并没有合理设计来干扰特定的分子靶点，而是根据它们在表型筛选中的强大抗疟特性进行鉴定的。因此对其作用机制（MoAs）的了解在大多数情况下仍处于初级阶段。在所有现有的抗疟药物中，除了青蒿素之外，喹诺宁是临床中使用最广的一类药物奎宁，甲氟喹以及氯喹直到今天还被广泛地运用于临床。尽管氯喹的抗疟作用似乎与抑制寄生虫消化液泡中的红素解毒密切相关，但是其他喹啉类药物的作用机制仍然不清楚。
现今，甲氟喹是ACT配方中的关键的药物，特别是在东南亚使用的甲氟喹仍然是疟疾的重要化学预防剂。上个世纪80年代，东南亚报道了两种药物的耐药性，并且其耐药性与pfmdr1基因复制的增加有关。pfdr1编码一种跨膜转运蛋白pfpGH1, 该转运蛋白被认为有介导药物从细胞质流入到消化液泡作用。这表明甲氟喹/奎宁的分子靶点存在于细胞溶胶中，因此两种药物的MOSA（至少一部分）与氯喹不同。与此一致的是，最近的研究表明，甲氟喹通过与80S核糖体结合来抑制转录，但是到目前为止还没有发现奎宁的具体靶点。

结果分析

CETSA对恶性疟原虫的适应性
在这项研究中，作者实施并验证了用MS-CETSA来鉴定恶性疟原虫蛋白质组中抗疟药物的直接蛋白质靶标。作者使用体外血液阶段恶性疟原虫寄生虫的细胞裂解物来研究直接药物-靶标相互作用（“裂解物”）。此外，作者还使用了完整的恶性疟原虫感染的红细胞来研究药物-靶标参与和随后的细胞环境中的下游效应（“完整细胞”）。由于红细胞（RBC）细胞质中高丰度的血红蛋白和碳酸酐酶-1，他们会影响MS分析，所以对于细胞内环境，作者使用了恶性疟原虫感染的磁性富集红细胞来进行实验。总的来说，作者采用了两种现有的CETSA数据收集策略变体（图1）:( i）熔解曲线CETSA方法，其中在存在或不存在药物的情况下在10个不同温度下监测蛋白质沉淀; （ii）等温剂量反应（ITDR）CETSA，即在单一温度下用多种药物浓度监测蛋白质稳定化。裂解物和细胞内CETSA数据集的交叉参考提供了辨别直接和间接药物作用的途径之一。
为了首先评估恶性疟原虫蛋白质组在滋养体阶段的融化特性，作者对未经处理的裂解物和完整细胞样品进行熔解曲线CETSA分析，确定蛋白质组范围内蛋白质在37°C至73°C温度范围内的热稳定性（图2A）。因此，作者计算了每个数据集中单个蛋白质熔解温度（Tm;相当于50％蛋白质变性）的分布（图2B）。得出的结果是从裂解物实验中分离的蛋白质表现出明显更高的整体热稳定性。特别地，在裂解物中存在显著更高比例的热稳定蛋白（44％）。因此，为了进一步分析，作者采用了更严格的标准在进行实验研究。作为这些严格标准的结果显示，完整细胞中的平均蛋白稳定性略低（ΔTm= 0.3°C）。这与对人类永生化髓性白血病（K562）细胞进行的类似比较一致。作者还观察到两种熔解曲线实验变体中的许多大蛋白复合物的相关沉淀（图S1），这与最近在人类细胞中描述的热邻近共凝集的概念一致（26）。在这里，作者发现RBC蛋白中的全局Tm分布通常高于恶性疟原虫或K562细胞蛋白质组（图S2）。

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基于CETSA的方法用于鉴定恶性疟原虫中的蛋白质药物靶标

为了鉴定恶性疟原虫中的药物 - 靶标相互作用，作者采用了CETSA方案的ITDR变体，使用从熔解曲线实验获得的信息（图2）。相对于非变性条件，ITDR中的靶蛋白参与被认为是响应于在单一温度下药物浓度增加的蛋白质稳定化（参见图1和材料和方法）。使用mineCETSA（一种内部开发的R包）进行数据分析，缩放和药物 - 靶标相互作用的鉴定（参见材料和方法）。
在缺乏关于药物的假定靶标的身份的先验知识的情况下，作者选择ITDR分析的热挑战温度，使得全局蛋白质组被充分取样。因此，对于随后的ITDR分析，作者选择对应于恶性疟原虫蛋白质组的平均Tm的51℃和57℃以解释在完整细胞样品中观察到的蛋白质组的更热稳定部分（图2B）。为了验证完整细胞CETSA中的这种策略，作者研究了E64d的蛋白质靶标参与，E64d是一种广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂，已知与恶性疟原虫蛋白质组中的几种靶标相互作用。得出的结果表明CETSA具有以高度特异性检测疟疾寄生虫蛋白质组中直接药物 - 靶标结合的能力。

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基于CESTA的恶性疟原虫甲氟喹和奎宁分子靶标的鉴定
接下来，作者进行了ITDR分析，以确定奎宁和甲氟喹的蛋白质靶标。对暴露于奎宁（0至10μM）或甲氟喹（0至100μM）的裂解物样品应用ITDR（51°C）方案，作者发现嘌呤核苷磷酸化酶（PfPNP; PF3D7_0513300）是唯一表现出高可信度稳定性的蛋白质。在两个数据集中同时检测到2157和2032个恶性疟原虫蛋白质（图4，A至D）。在用甲氟喹进行的两个相应的完整细胞ITDR中未观察到PfPNP的稳定化，这揭示了三种其他蛋白质的剂量依赖性稳定化。丙酮酸激酶II（PfPyKII; PF3D7_1037100）在完整细胞ITDR（57℃）中表现出早期剂量依赖性稳定化（MDT，~19.5nM）。然而，这伴随着37℃下蛋白质丰度的增加，表明稳定化可能反映了药物结合的下游效应，也导致蛋白质水平增加。考虑到PfPyKII对于寄生虫的代谢至关重要，参考条件下蛋白质丰度的变化可能代表对药物引起的扰动的一般应激反应。在完整细胞ITDR（57℃）中也观察到两种线粒体蛋白热休克蛋白70（Hsp70-3; PF3D7_1134000）和GrpE蛋白同源物（Mge1; PF3D7_1124700）的稳定化，但仅在最高药物剂量下可检测到（10μM）（图S4）。这可能反映了由恶性疟原虫细胞中甲氟喹诱导的反应性氧化物种（ROS）对线粒体膜的间接影响。尽管甲氟喹具有更广谱的恶性疟原虫蛋白（包括PfPNP），但在MS-CETSA中，奎宁似乎几乎完全参与PfPNP。使用Western印迹进一步验证，直接再现观察到的PfPNP稳定性的变化（图S5）。因此可以想象，PfPNP不仅在奎宁的MoA中起主要作用，而且还可以促成甲氟喹的MoA。我们还在完整细胞ITDR实验中观察到响应奎宁（MDT，0.15μM）的人线粒体60-kDa热休克蛋白（HSPD1; P10809）的稳定化（图S6）。目前，关于宿主蛋白在寄生虫生长和/或其在药物MoAs中的作用的作用知之甚少。尽管如此，这些结果可能表明它们的生物学相关性。
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奎宁和甲氟喹与PfPNP结合的体外验证
为了进一步评估PfPNP与奎宁和甲氟喹的相互作用，作者使用异源表达的重组PfPNP在体外研究了结合特性。首先，我们使用差示扫描荧光测定法（DSF）监测奎宁和甲氟喹对PfPNP的相对稳定作用（图5A）。总体而言，DSF证明ImmH，奎宁，甲氟喹和奎尼丁具有剂量依赖性稳定作用。为了补充DSF分析，我们使用表面等离子体共振（SPR）研究了奎宁和甲氟喹与重组PfPNP的亲和力和结合动力学（图5，B和C）。使用单轮和多轮稳态或动力学拟合实验测量三种化合物的结合和解离速率（表S2）。如所预期的，ImmH显示出对PfPNP的紧密结合和非常慢的解离速率，平衡常数（KD）为约250pM。喹啉对PfPNP的亲和力较低。最后，作者通过等温滴定量热法（ITC）验证了观察到的PfPNP与奎宁和甲氟喹的结合。 ITC结果也与SPR结果非常一致，显示出对奎宁（KD = 65 nM）和甲氟喹（KD =11μM）的相似结合亲和力（图S7和表S3）。
接下来，作者使用体外酶测定法，监测PfPNP催化的肌苷向次黄嘌呤的转化，以研究奎宁和甲氟喹对PfPNP的抑制作用。两种药物均阻断PfPNP酶活性。然而，这些值与SPR和ITC的亲和力相关，表明奎宁和甲氟喹都与PfPNP相互作用，尽管亲和力低于ImmH。在两种抗疟疾化合物中，奎宁对PfPNP具有始终较高的亲和力并且增加了抑制活性，这也反映在最初的ITDR CETSA测量中。因此，PfPNP的抑制可能与奎宁的MoA相关，而PfPNP与甲氟喹相互作用的临床相关性可能不太相关。为了检验这种可能性，作者在体外培养的恶性疟原虫中评估了两种药物与ImmH组合的抗疟活性。作者使用等效线图分析，用于揭示药物对之间的协同和/或拮抗作用。在组装的等效线图中，与ImmH组合时，两种喹啉均诱导了较低的杀灭效果（奎宁，ΣFIC50≤1.43;甲氟喹，ΣFIC50≤1.70）。在所测试的药物比例中可以观察到两种异构体的显着偏差，这表明药物拮抗作用。相比之下，ImmH与E64d组合的等效线图预计不会与PfPNP相互作用，显示出与线性函数的偏差幅度明显较低（平均值ΣFIC50= 1.09），表明加性独立活动。因为PfPNP是ImmH和两种喹啉药物中唯一已知的共同靶标，所以观察到的拮抗作用可能是由于与PfPNP活性位点结合的竞争引起的。
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甲氟喹和奎宁的晶体结构与PfPNP结合

为了进一步阐明PfPNP的抑制模式，作者分别用1.66和2.30Å的分辨率确定了蛋白质与奎宁和甲氟喹的共晶结构。结构显示两种化合物都结合在PfPNP的活性位点袋中（图6，A和B），这与它们对酶活性的有效抑制一致。在共结晶的PfPNP-奎宁和PfPNP-甲氟喹配合物中观察到的PfPNP折叠高度相似，这表明两种结构之间原子定位的低度可变性[即，Cα原子的均方根偏差（RMSD）为0.2一个]。整体结构也与先前测定的PfPNP-肌苷（RMSD，0.34 /0.41）和PfPNP-ImmH·SO 4（RMSD，0.24 /0.28）的复合物非常相似（图S8）。

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讨论回顾

疟原虫寄生虫的特征在于结合了动物和植物样特征的独特生物学，因此与其他真核系统相比仍然知之甚少。因此，为研究其他真核系统中的药物活动而开发的研究工具已被用于研究这些原生动物，但效果有限。因此，即使对于临床使用已有数十年的化合物，我们对绝大多数抗疟药物的MoAs的理解仍然不完整。在这里，作者探索了CETSA方法，用于直接在恶性疟原虫细胞中鉴定抗疟疾化合物的蛋白质靶标。
奎宁和甲氟喹似乎具有重叠的MoAs，两种药物的MoAs似乎同时涉及几种生物过程的破坏，但对于奎宁，先前未发现直接的蛋白质靶标。相反，最近提出了甲氟喹与80S核糖体的直接相互作用，导致寄生虫蛋白质合成的减弱。在这里，作者显示奎宁和甲氟喹与疟原虫细胞中的PfPNP相互作用，并且两种药物都具有抑制PfPNP酶活性的能力。虽然奎宁和甲氟喹在最初的基于裂解物的CETSA中表现出与PfPNP相当的热稳定性（奎宁的MDT--0.1μM和甲氟喹的约0.6μM），但在后续研究中，奎宁表现出高达三个数量级的亲和力。对这种酶，奎宁能够以结合常数Ki~140nM抑制PfPNP酶活性，这表明其作为临床相关活性的潜力。
在奎宁和甲氟喹与ImmH的细胞毒性作用之间观察到的拮抗相互作用支持了PfPNP抑制有助于其抗疟活性的观点。然而，虽然immucillins通过同时抑制宿主和寄生虫PNP酶发挥其抗疟作用，但我们没有发现奎宁和甲氟喹与人PNP相互作用的证据。
鉴于新出现的青蒿素抗性，对疟疾的新疗法的需求变得尤为迫切。通过公共和私营部门的共同努力进行的高通量表型筛选测试了数百万种化合物，这些化合物对恶性疟原虫的不同发育阶段产生了数万个活性<1μM的分子。剩下的主要挑战之一是确定最有效化合物的内在分子靶标，同时优先考虑新的化学型。过去几年为恶性疟原虫开发的新技术提高了我们识别和验证候选药物目标的能力。然而，MS-CETSA与用于药物靶标识别的现有工具相比具有几个优点。其在大部分寄生虫蛋白质组中监测与蛋白质靶标的直接生物物理结合的能力同时使其适合于鉴定具有先前未确定的作用模式的化合物的药物靶标。CETSA的无标记原则允许其与选择的寄生虫菌株和标准未修饰化合物一起使用，从而减少合成特殊药物探针所需的时间和成本。我们相信，恶性疟原虫MS-CETSA的开发可以补充现有工具，促进抗疟药物靶点发现工作，并有助于进一步加深我们对寄生虫生物学的理解。