今天小编要给大家解读一篇利用系统免疫学框架识别免疫微环境的候选lncRNA修饰物的文章，这些候选的TIL-lncRNA可以对泛癌进行重新分型，并与免疫特征及患者临床预后相关,不仅如此，由TIL-lncRNA衍生出的TISI得分是预测患者预后以及免疫治疗反应的有效指标。这篇文章内容丰富，实践相对简单，如果大家想要进行lncRNA-免疫方面的研究，这篇文章可以为大家提供思路。
“免疫微环境lncRNA修饰物的泛癌表征揭示了临床上不同的新肿瘤亚型”于2021年6月17发表在npj Genomic Medicine杂志上，影响因子8.6。
免疫微环境lncRNA修饰物的泛癌表征揭示了临床上不同的新肿瘤亚型
研究背景
首先，癌症受肿瘤微环境 (TME)的影响，而TME会形成肿瘤免疫微环境 (TIME)，其中的免疫成分是TME的重要标志特征。浸润性免疫细胞在TME中的复杂性和多样性可以发挥促癌和抗癌作用，并影响多种临床结果和免疫治疗的反应。
其次，研究表明lncRNA 在免疫系统的发育和功能中发挥关键作用。它在各种免疫细胞类型中表达，并有助于免疫细胞的发育、分化和激活。lncRNA 还可以直接和/或间接参与TIME内肿瘤细胞和浸润性免疫细胞之间的串扰，以参与癌症的发生和进展。此外，某些 lncRNA 已被证明可以影响和调节TIME内免疫细胞的迁移和浸润，并与肿瘤的免疫逃逸和预后相关。
最后，尽管有证据表明 lncRNA 参与重塑 TIME，但已知的浸润性免疫细胞的 TIL-lncRNA 是有限的，需要进一步表征。因此，研究者构建了一个系统免疫学框架，用于通过对 30 种实体癌类型的 9549个肿瘤样本的非编码转录组和免疫基因组学特征进行综合分析，确定 TIME 内浸润性免疫细胞的潜在lncRNA修饰候选物。不仅如此，研究者还研究了 TIL-lncRNA 对肿瘤行为和疾病预后的具体影响。
研究方法
流程图
结合流程图，我们梳理一下文章的思路及具体用到的方法：
首先，获取TCGA的多组学数据，转录组学数据以及接受PD-1/ CTLA-4阻断疗法治疗的肿瘤患者的临床信息，特别说明一下临床信息包括四组先前发表的临床试验：Miao 研究的 16 名ccRCC患者（Miao 队列），Zhao 研究的 34 名GBM患者（Zhao 队列）、37名来自 VanAllen 研究的转移性黑色素瘤患者（VanAllen 队列），以及来自 Gide 研究的 76 名黑色素瘤患者（Gide 队列）。
接下来，根据转录组学信息利用去卷积的方法获得22种浸润性免疫细胞的丰度。
第三步就是本文最关键的部分，根据lncRNA表达谱、免疫maker基因和浸润性免疫细胞丰度构建系统免疫学框架，识别肿瘤浸润性免疫细胞的候选lncRNA修饰物（TII-lncRNAs）：
系统免疫学框架：
(1)所有lncRNAs根据它们与免疫maker基因的共表达关系进行排序，并且具有显著较高Pearson 相关系数 (PCC)的lncRNA被认为是免疫基因相关的lncRNA；
(2)这些免疫基因相关的 lncRNAs 根据它们的表达与给定浸润性免疫细胞群丰度之间的相关性进行排序，那些具有显著更高 PCC的lncRNA被认为是候选 TII-lncRNAs；
(3)使用给定免疫细胞群的上下四分位数将样本分为高免疫浸润组和低免疫浸润组。在具有高免疫浸润和低免疫浸润的肿瘤之间显著差异表达的候选 TII-lncRNA 被定义为 TII-lncRNA。
(4)使用 R 包“ConsensusClusterPlus”，用 K-means 方法和欧几里德距离基于TII-lncRNA 的表达对TCGA泛癌患者进行共识聚类分析以发现新的泛癌亚型。
(5)发现泛癌亚型后，下一步是比较亚型间的免疫学特征、临床特征以及生物学特征的差异。对于免疫特征来说，需要使用 ESTIMATE通过ssGSEA计算基质得分和免疫得分；使用来自 Roeland 研究的 20 个 ICR 特征基因的标准化 log2 转换的表达值均值计算免疫排斥常数 (ICR) 评分；用每个患者中两个关键细胞溶解效应物、颗粒酶 A 和穿孔素的几何平均值计算细胞溶解活性 (CYT) 评分；获得免疫检查点基因（ICG）的表达；使用 R 包“GSVA”进行单样本基因集富集分析 (ssGSEA) 以计算每个患者的富集分数 (ES)，免疫特征和maker基因集来自MSigDB数据库。对于生物学特征来说，需要量化每位患者上皮间充质转化 (EMT) 的作用和动态，具体方法是从先前的研究中获得了 94 个间充质和 111 个上皮细胞maker基因，并且使用上皮细胞maker基因和间充质细胞maker基因的表达之间的t检验分数计算 EMT 分数; 获取DNA 损伤反应maker基因等。
(6)使用 36 个 TII-lncRNA 的平均表达水平计算 TISI。
最后，则是探究TISI与免疫特征的相关性及其预测患者生存和免疫治疗反应的能力，生存分析是使用单变量和多变量 Cox 比例风险回归模型来评估TISI与有/无临床变量的总生存率之间的关系。计算风险比 (HR) 和 95% 置信区间 (CI)。用Kaplan-Meier方法和对数秩检验比较两个肿瘤组之间的生存差异。研究中凡是两组进行比较的都使用双边 Wilcoxon 秩和检验。ROC曲线用于评估对免疫治疗反应的预测性能，并计算曲线下面积（AUC）。
研究结果
1.从浸润性免疫细胞-lncRNA串扰的角度推导与不同免疫学特征相关的新泛癌亚型
系统免疫学框架识别了36 个TII-lncRNA。
为了探索这些 TII-lncRNA 是否可以发现分子亚群，基于 36 个 TII-lncRNA 的表达模式对所有 TCGA 患者进行了共识聚类，发现了三个主要泛癌亚型（TIIL-C1 至 -C3）。
检查了三种亚型中每种癌症类型的患者分布，并通过将每个亚型中具有给定癌症类型的患者数量与该亚型中任何癌症类型的患者数量进行比较，并通过执行超几何检验来计算ES以评估统计学显著性。如图所示，17种癌症类型样本在TIIL-C1亚型中过度分布，12 种癌症样本在TIIL-C2亚型中过度分布。脑肿瘤在TIIL-C3亚型中过度分布。由于TIIL-C1和TIIL-C2亚型的癌症类型分布相对均匀，因此，随后的实验基于这两个亚型进行分析。
接下来，通过比较TIIL-C1和TIIL-C2之间的基质、免疫、CYT和ICR得分，以及ICG的表达、免疫细胞丰度和免疫通路活性来检查TIME的特征。如图所示，与TIIL-C2亚型相比，TIIL-C1 亚型显示出显著更高的免疫得分和更低的基质得分。与TIIL-C2 亚型相比，TIIL-C1 亚型的 ICR 和 CYT 得分也显著更高。对 22 个免疫细胞群的相对丰度进行进一步分析表明，TIIL-C1 亚型具有显著更高水平的适应性和激活免疫细胞浸润，而TIIL-C2亚型表现为低浸润的适应性和活化免疫细胞以及高浸润的失活免疫细胞。此外，与 TIIL-C2 亚型相比，TIIL-C1 亚型中的 ICG 趋于显著上调。通路富集分析表明，与 TIIL-C2 亚型相比，TIIL-C1 亚型的免疫通路上调。生信人
总体而言，这些结果表明 TIIL-C1 亚型可能与免疫活性微环境表型相关，而 TIIL-C2 亚型可能与免疫沉默微环境表型相关。
为了证实TII-lncRNA衍生亚型分类的稳定性和可靠性，随机抽取40%或60%的样本，根据36个TII-lncRNA的表达情况对剩余的60%或40%的样本进行相同的共识聚类，进行随机分析。随机分析的结果与整个TCGA泛癌样本的分析结果相同，表明36个TII-lncRNA分类的有效性和稳健性。
2.TII-lncRNA衍生的泛癌亚型之间的生物学和临床差异
接下来，探讨了不同 TII-lncRNA 衍生亚型的临床相关性。泛癌生存分析显示，TII-lncRNA衍生亚型与患者生存显著相关，TIIL-C2 亚型的总体生存率明显优于TIIL-C1 亚型。
癌症特异性生存分析揭示了TII-lncRNA衍生的亚型与多种癌症类型的总生存之间的关系，观察到了与泛癌分析中相似的预后趋势。
然后进一步检查了不同 TII-lncRNA 衍生亚型的肿瘤是否具有不同的生物学特征，包括 EMT过程、DDR maker基因的表达。通过检查肿瘤的EMT状态，发现TIIL-C1亚型中肿瘤的EMT 得分明显低于 TIIL-C2 亚型。TIIL-C1 亚型的肿瘤中，总共有 81/94 上皮标志物上调，而在 TIIL-C2 亚型中，74/111 间充质标志物上调。与 TIIL-C2 亚型相比，总共发现 169/309 个DDR基因在TIIL-C1 亚型中上调。
此外，在 TIIL-C1 和 TIIL-C2 亚型之间观察到 DDR 基因突变总数存在显著差异。TIIL-C1 亚型具有高水平的肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性和拷贝数变异的特征。
ssGSEA的基因集富集分析显示TIIL-C1亚型与几乎所有癌症标志性途径的高度激活相关。
总之，这些发现表明TII-lncRNA衍生不同亚型肿瘤间生物学和临床行为是异质的。
3.TISI的开发
考虑到TII-lncRNA衍生亚型与TIME以及生物学和临床行为的关系，进一步构建了TISI，以反映肿瘤的亲和免疫表型。
如图所示，在TIIL-C1亚型中过度分布的癌症表现出较低的TISI，而在TIIL-C3亚型中过度分布的癌症表现出更高的TISI。
此外，TISI与免疫、CYT和 ICR得分显著负相关，并且与基质和EMT得分显著正相关。
接下来，检查了免疫细胞群丰度与TISI之间的关联，发现TISI与适应性免疫细胞群的丰度呈负相关，并与先天性免疫细胞群的丰度呈正相关。这一观察结果表明 TISI 在捕获肿瘤的抗肿瘤免疫方面具有巨大潜力。
进一步的maker通路富集分析揭示了参与免疫抑制的通路富集，这些通路与TISI显著正相关，而大多数癌症相关通路的富集与TISI呈负相关。这些结果表明 TISI 不仅与肿瘤间免疫状态相关，而且还反映了致癌状态，而致癌状态是对患者预后的预测。
因此，研究了TISI在预测泛癌生存中的意义。泛癌生存分析显示 TISI与患者的生存显著相关。
此外，在泛癌分析中调整其他标准临床特征后，TISI与生存率保持显著相关性。
4.TISI为肿瘤免疫学和分子亚型提供额外的预后价值
进一步研究了 TISI 定义的风险组与免疫特征集定义的免疫亚型 (IS) 之间的相关性。TISI定义的风险组存在于所有IS中，但它们在IS之间的相对分布有所不同。TISI定义的风险组在C4淋巴细胞耗竭的IS中分布相对平等。
进一步观察表明，一些低TISI肿瘤也发生在C3炎症性 IS 中，一些高TISI肿瘤发生在C6-TGF-β 显性IS中。因此，对C3炎症、C4淋巴细胞耗竭和C6-TGF-β显性IS的TISI进行了分层分析。尽管据报道 C3炎性IS具有最佳预后，但TISI仍然能够从C3炎性IS中识别出预后不良的高风险患者亚组。
尽管已知 C4 淋巴细胞耗竭和C6-TGF-β占优势的IS中的肿瘤具有最不利的结果，但TISI可以有效区分相同C4淋巴细胞耗竭和C6-TGF-β占优势的IS的高危和低危患者。对于具有高和低 TGF-β信号的患者，与低TISI相比，高 TISI 与改善生存显著相关。在C4淋巴细胞耗竭的 IS 中观察到相反的趋势，其中高 TISI 与低 TISI 相比与较差的存活率略微显著相关。
接下来评估 TISI 定义的风险组与先前基于mRNA 的共识分子亚型 (CMS) 的相互作用，并选择KIRC和KIRP进行研究。发现 TISI 定义的风险组跨越CMS，并且在CMS亚组的分布上没有实质性的异质性。
然而，TISI 可以有效地将 KIRC 和 KIRP 不同 CMS 亚组中的患者分层为具有显著不同总生存率的不同风险组。与 TISI 低的患者相比，TISI高的患者的生存率显著提高。
5.TISI作为免疫治疗反应预测因子的潜力
通过检测TISI与ICGs表达的相关性，发现TISI与6种ICGs的表达呈显著负相关(LAG3，CTLA-4， FADLG，TIGIT，PD-1，PD-L1)。
因此，研究了 TISI 是否可以作为基因组工具来预测免疫检查点抑制剂 (ICI) 的治疗反应。在接受抗 PD-1 和抗 CTLA-4 治疗的四个患者队列中，通过单Cox 回归分析评估 TISI 的预后价值，并使用meta分析进行整合以估计整体预后效能。增加的 TISI 与 ICI 治疗后的良好预后显著相关。
包含详细临床信息的 Zhao 和 Miao 队列被进一步分析，以验证 TISI 在 ICI 反应中的预测价值。对这两组患者中 36 个 TII-lncRNA 的表达模式的分析揭示了两组患者具有不同免疫治疗反应的簇。
此外，TISI 不仅与患者的免疫得分显著负相关，还将患者分为具有明显不同生存率的 TISIhigh 和 TISIlow 组。
TISI 和 ICI 反应之间关联的趋势表明，低 TISI 显著富集到对 ICI 反应更敏感的患者，而高 TISI 主要富集了对 ICI 更具抵抗力的患者。
此外，ROC 分析表明，与传统的免疫生物标志物 PD-1、PD-L1 和 CTLA-4 相比，TISI 在预测对 ICI 治疗的反应方面表现出预测优势或相当的性能。
这些结果支持TISI是ICI治疗有效性的潜在预测生物标志物。
研究结论
在此研究中，系统免疫学框架整合了 30 种实体癌的 9549 个肿瘤样本的非编码转录组和免疫基因组学谱，36 个 lncRNA 被鉴定为泛癌水平的 TIME 浸润性免疫细胞的潜在修饰候选物。这些TIL-lncRNA能够将各种肿瘤细分为三种具有不同免疫学特征、生物学行为和疾病预后特征的新泛癌亚型。最后，提出了一种 TIL-lncRNA 衍生的TISI，它不仅可以反映免疫学和致癌状态，也可以预测患者的预后。此外，TISI 为现有的肿瘤免疫学和分子亚型提供了额外的预后价值。总之，本研究为lncRNA介导的癌症免疫的未来功能和机制研究提供了全面的资源和见解，并强调了基于lncRNA的免疫治疗策略在精准免疫治疗中的临床应用潜力。
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