Cancer Discovery ：胃癌单细胞图谱

单细胞测序技术能够揭示单个细胞的基因表达状态，反映细胞间的异质性，发现新的稀有细胞类型。当前单细胞测序技术的一个限制是需要组织解离，导致空间信息的丢失。为了解决这个问题，空间转录组学平台则保留了空间结构，从而允许以前所未有的深度分析肿瘤与肿瘤微环境的相互作用。

下面分享一篇在 Cancer Discovery 上发表的题为：Single-cell atlas of lineage states, tumor microenvironment and subtype-specific expression programs in gastric cancer 的研究论文。

科学问题

胃癌（GC）是导致全球癌症发病率和死亡率的主要原因，其表现出高水平的患者间和患者内的异质性。通过前期群体测序已知每个胃肿瘤样本都具有独特的表达谱。然而，我们对肿瘤微环境（TME）中各细胞类型如免疫细胞、成纤维细胞等驱动 GC 表型的机制的理解仍处于初级阶段。

技术方法及路线

思路流程图 实验设计图

主要结论

1、scRNA-seq 识别异质性细胞群、细胞命运轨迹和稀有细胞群

40 个样本的 152,423 个细胞降维，分成34 个群（图 1B），5 种细胞大类，各细胞类型在组间占比不同（图 1C）。浆细胞群的单细胞拟时序分析表明了浆细胞分化和成熟的不同阶段（图 1E)。此外，鉴定到一种新型稀有细胞类型 STF4。STF4 细胞群表达 PLVAP（内皮细胞标志物）和 RGS5（成纤维细胞标志物），暗示了一种罕见的混合谱系群体（图 1F）。作者也使用双色 RNAScope 技术验证了 PLVAP/RGS5 双阳性群体的存在。STF4 细胞群可能突出显示经历内皮-间充质转化（EndoMT）的细胞，这是一个内皮细胞获得间充质或肌成纤维细胞表型的过程。综上，这些结果展示了 scRNA-seq 揭示异质性细胞群、细胞命运轨迹以及稀有细胞群的能力。

图1：scRNA-seq 识别异质性细胞群、细胞命运轨迹和稀有细胞群

2、scRNA-seq 识别胃癌细胞特异性转录

与正常组相比，肿瘤中上皮细胞的比例较低，骨髓细胞较高。淋巴样、血浆和基质细胞的比例没有差异。与正常组织相比，肿瘤相关上皮细胞表现出更高致癌基因特征表达（图 2B）。GC 癌基因（如 CEACAM6、EGFR、MET、CCND1 和KRAS ）的表达在 EpiInt1 肿瘤上皮细胞亚群上调最大（图 2C）。与正常相比，肿瘤相关上皮细胞表现出显著异常 CNV（图 2D）。比较同一细胞类型组间（肿瘤组和正常组）差异显示，“主要细胞”和“肠型细胞”差异最大（图 2E）。LIPF 和 PGA3 在肿瘤中下调（图 2F）。使用 DSP 空间转录组技术，作者证实了与正常样本相比，肿瘤上皮细胞（PanCK+）中 LIPF 的下调表达（图 2G）。成纤维细胞细分三个亚群（图 2H）。综上，在 GC 肿瘤生态系统中，来自上皮和肿瘤微环境的不同细胞表达不同的致癌转录组学特征 —— 每种特征都是不同癌症所必需的，并最终会混合以产生复合肿瘤分子图谱（图 2I)。

图2：scRNA-seq 识别胃癌细胞特异性转录

3、scRNA-seq 揭示弥漫型胃癌中 KLF2 相关的浆细胞富集

与肠型 GC 相比，弥漫型 GC 中浆细胞相对比例更高，上皮细胞较低，淋巴、骨髓和基质细胞群没有差异（图 3A）。使用 IRF4（浆细胞标记物）免疫组化（图 3B）证实了弥漫型肿瘤中浆细胞水平的增加。重新分析 TCGA 中群体转录组数据，进一步验证了弥漫型 GC 中浆细胞水平的增加（图 3C）。单细胞数据表明弥漫型 GC 中浆细胞的富集主要由浆细胞簇 PL4 和 PL5 驱动（图 3D）。KLF2 是一种先前显示可调节多发性骨髓瘤中浆细胞归巢的基因。作者观察到浆细胞比例与表达 KLF2 的上皮细胞之间存在显著相关性（图 3E）。这一发现表明，高表达 KLF2 的上皮细胞可能与弥漫型 GC 中的浆细胞募集有关。ChIP-seq 和群体转录组测序发现弥漫型 GC KLF2 H3K27ac 启动子水平和基因表达均高于肠道 GC，启动子信号和基因表达之间具有良好的相关性。分析 TCGA 群体转录组测序数据进一步证实与肠型肿瘤相比，弥漫型肿瘤 KLF2 表达增加（图 3F）。为了探索空间环境中 KLF2 的差异，作者使用 DSP 空间转录组技术来分析 KLF2 在上皮细胞（Pan-CK+）中的表达。结果证实与肠型上皮细胞相比，弥漫型上皮细胞中的 KLF2 转录水平更高（图 3G）。此外，作者观察到与远端上皮细胞相比，靠近浆细胞的上皮细胞中 KLF2 表达更高（p = 0.096）（图3H）。进一步作者通过人源化小鼠模型及细胞共培养体外迁移实验证明肿瘤上皮细胞中 KLF2 表达与宿主浆细胞之间的关系（图 3I-J）。总之，研究结果确定了弥漫型 GC 中浆细胞募集，上皮细胞 KLF2 表达作为浆细胞募集的潜在驱动因素。

图3：组织学亚型之间的差异分析确定弥漫型肿瘤中浆细胞增加

4、scRNA-seq 揭示了不同的成纤维细胞亚群和 INHBA-FAP作为肿瘤成纤维细胞调节因子

作者根据临床分期和组织学亚型比较了 scRNA-seq 中的肿瘤成纤维细胞亚群（STF1-3），结果表明三个亚群都呈阶段性增加（图 4A）。STF1 和 STF3 簇表现出 FAP、ACTA2、TAGLN 的上调，STF2 簇仅表现出 CSPG4 的上调（图 4B）。据报道，TGF-β 超家族信号会影响其他癌症类型中的肿瘤成纤维细胞（CAF）的功能。因此，作者选择研究 TGF-β 通路的主要组成部分激活素-抑制素信号传导模块，包括 9 个经典基因。在这 9 个基因中，与正常相比，只有 INHBA 在肿瘤相关的 STF2 和 STF3 簇中表现出显著上调（图 4C）。INHBA 与STF3 中的 FAP 呈显著正相关，而与 STF2 中的 CSPG4 未发现相关性。空间 DSP 数据分析表明 FAP 和 INHBA 在肿瘤成纤维细胞（SMA+）中的表达高于正常（图 4D-F），并且在肿瘤成纤维细胞中 FAP 和 INHBA 共表达水平存在很强的相关性（图 4G）。作者进一步通过体内外系列功能实验表明 INHBA 正调节胃癌 STF3 成纤维细胞群中 FAP 表达（图4H-J）。研究还发现从正常到 IV 期 STF3 中 FAP 和 INHBA 表达增加（图 4K）。通过 INHBA 表达水平对 TCGA 样本进行的生存分析显示，具有高 INHBA 表达的肿瘤样本的生存率显著降低（图 4L）。

图 4：scRNA-seq 识别不同的成纤维细胞亚群和 INHBA-FAP 作为 CAF调节因子

5、胃癌类器官的 scRNA-seq

为了研究与体内原代肿瘤相比，体外类器官培养条件对转录状态或整体细胞比例的影响，作者将来自患者类器官（PDO）的 scRNA-seq 数据集与原发肿瘤进行整合分成五个主要的细胞群（图 5A）。与正常 PDO 上皮细胞相比，肿瘤 PDO 上皮细胞表现出癌症相关模块和 GC 相关基因的上调（图 5B）。对正常和肿瘤 PDO 中上皮细胞的轨迹图分析表明，来自肿瘤类器官的上皮细胞相对于正常上皮细胞具有多个分支，这与正在经历普遍和持续分化或去分化的肿瘤 PDO 上皮细胞一致（图 5C）。研究者进一步揭示了原发肿瘤和 PDO 之间的差异（图 5D-G）。总之，这些结果提出了一种可能性，即除了上皮细胞外，PDO 培养也可能影响与肿瘤相关的其他细胞类型的转录谱。

图 5：原发肿瘤和类器官的 scRNA-seq 比较

总结

该研究对超过 30 名具有不同亚型和阶段的胃癌患者的扩展队列进行了 scRNA-seq，跨越大量细胞（＞200,000 个细胞）生成了全面的胃癌单细胞图谱。共鉴定到34个细胞群，包括新的稀有细胞群。观察到弥漫型肿瘤中浆细胞比例增加，以及以高 INHBA 和 FAP 共表达为特征的癌症相关成纤维细胞亚群的分期积累。单细胞分析比较了患者来源的类器官（PDO）和原发性肿瘤之间的相似性和差异。通过 DSP 空间转录组学、独立的群体 RNA-seq 以及体外和体内模型的功能实验来补充这些发现。该研究提供了跨不同胃癌亚型的患者内部和患者间单细胞高分辨率分子图谱。