后续要补上“质粒转化、扩增和鉴定的过程”

CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) ：成簇规律间隔短回文重复序列；

II型CRISPR系统=核酸酶Cas9 + 编码gRNA的crRNA array + 有助于将crRNA阵列加工成离散单元的所需辅助反式激活crRNA (tracrRNA)

The Type II CRISPR system is one of the best characterized consisting of the nuclease Cas9, the crRNA array that encodes the guide RNAs and a required auxiliary trans-activating crRNA (tracrRNA) that facilitates the processing of the crRNA array into discrete units.

gRNA用于引导，tracrRNA用于结合靶点

Furthermore, the crRNA and tracrRNA can be fused together to create a chimeric, single-guide RNA (sgRNA).

Cas9 can thus be re-directed toward almost any target of interest in immediate vicinity of the PAM sequence by altering the 20-nt guide sequence within the sgRNA.

image.png
image.png
PAM必须紧跟在20-nt对应的靶向基因的下游——降低脱靶效应

image.png

1. Precise genome editing using engineered nucleases

简单的背景介绍，说明精确编辑的重要性，有什么样的核酸酶。

2. Cas9: an RNA-guided nuclease for genome editing

详细介绍Cas9，并且介绍sgRNA。

3. Comparison with other genome editing technologies

简单的对比一下不同的基因编辑工具的优缺点，突出CRISPR-Cas9的优点

4. Limitations of the Cas9 system

简述CRISPR-Cas9的缺点

5. Experimental design

实验设计部分

(1) Target selection for sgRNA.
先确定要干嘛（敲除还是编辑），然后设计sgRNA

(2) Approaches for sgRNA construction and delivery.
确定sgRNA的表达方式，既然Cas9是需要sgRNA帮助来识别靶点的，那么sgRNA在细胞内该如何产生呢？这里提供了两种办法，PCR扩增法还有质粒表达法。

(3) Design of repair template.
这部分是设计模板，HDR（同源修复）有两种模板，一种是我们设计好插入到质粒中，另外一种呢是ssODN。想清楚选择哪一种。

(4) Clonal isolation of cell lines.
将带sgRNA表达的质粒或者载体+模板一起转染细胞，并且最后通过筛选标记分离（抗生素抗性或者荧光筛选）。

(5) Functional testing.
验证基因编辑的效果。

Procedure——实验步骤

1. sgRNA or ssODN（单链DNA寡核苷酸）

sgRNA辅助Cas9识别靶点，而Cas9造成DNA的双键断裂（DSB）切口之后，DNA需要自我修复。

没有模板的就是易出错的非同源末端连接修复（NHEJ），引入in-del（移码突变和终止密码子的过早出现）实现敲除；有模板的，这部分模板就会接上去，就造成了插入，这就是我们常说的（HDR）。

那么说到HDR是需要模板的，模板又分为两种，一种呢是在质粒上的，另一种比较简单，是ssODN。

因此，首先要确定的是，到底是想做敲除呢，还是想做插入。

1.1 Design of targeting components and the use of the CRISPR Design Tool

1.2 Design of the ssODN template (optional)

2. Preparation of sgRNA expression construct——knock down

(A) Generation of the sgRNA expression construct by PCR amplification

(B) Cloning sgRNA into the pSpCas9(BB) vector for co-expression with Cas9

3. Functional validation of sgRNAs

转染细胞

Co-transfection of CRISPR plasmids and HDR templates into HEK 293FT cells (optional)
这是我们前面提到的，如果要做HDR修复的话，那就需要模板，需要将质粒和模板共转。

hESC (HUES 9) culture and transfection
因为多能干细胞和普通细胞的转染是不一样的，所以单独放出来给大家参考。

筛选细胞

Isolation of clonal cell lines by FACS
通过荧光筛选细胞的实验步骤。

Isolation of clonal cell lines by serial dilutions
通过挑单克隆的方法筛选

编辑效果

Functional testing: detection of indel mutations by the SURVEYOR nuclease assay
通过SURVEYOR核酸酶实验验证效果，这部分我没有用这个酶，我们用的是T7 Endonuclease I，这个酶可以识别DNA上错配的地方，然后给切开。

Functional testing: detection of genomic microdeletions by PCR
通过PCR实验验证删除和倒置。
(A) Deletion or microdeletion analysis
(B) Inversion analysis

Functional testing: genotyping of HDR-mediated targeted modifications by restriction-fragment length polymorphism (RFLP) analysis
限制性片段长度多态性验证HDR介导的基因编辑结果。

Assessment of Cas9 cleavage or HDR-mediated target modification efficiency by Sanger sequencing
测序验证

Deep sequencing and off-target analysis
脱靶效应

程序总览

CRISPR敲除步骤总览.png

思路图

image.png
image.png

补充：近年来出现的其他基因编辑技术：ZFNs（锌指核酸酶），TALENs（转录激活因子样效应物核酸酶）。But！ 无论是 ZFN 还是 TALEN，这两种人工核酸酶都是由 DNA 结合蛋白与核酸内切酶Fok I 融合而成，这就意味着，当需要对新的DNA靶点进行编辑的时候，就需要设计新的核酸内切酶序列