枯草芽孢杆菌中优化启动子过表达外源蛋白

本文挖坟2019年发表在Microb Cell Fact上的一篇文章
Promoter engineering enables overproduction of foreign proteins from a single copy expression cassette in Bacillus subtilis
存在问题：与多拷贝质粒表达相比， 染色体整合下重组蛋白的表达水平可能无法满足生产的要求

文献思路

通过优化改造Pylb自诱导型启动子， 实现单拷贝表达盒染色体整合下重组蛋白的高效表达。

最终效果

材料篇：

Plasmid pAX01，淼灵生物有现货质粒
其他基因组序列从NCBI下载

培养基：
2 × SR培养基：由3%胰蛋白胨、5%酵母膏和0.6% K2HPO4组成，pH 7.2。

实验步骤

1. bgaB扩增
bgaB encoded β-galactosidase
找不到质粒plasmid pLJ-2序列，就从168基因组上模拟扩增；

命名为：1.1 P1-bgaB-P2

1.2 WT promoter Pylb
从168基因组上模拟扩增；
扩增的是野生型carrying the Pylb promoter from B. subtilis 168 genome was generated using the primer pair P3/P4.
命名为：1.2 P3-promoter Pylb-P4

caaattgaggataacacattcatACGTTCTACCTTTGTCAAACAAATCTCCCCCTTTGTTGTTTCTACATATATTGTAAACGCTTTATTTAAAAAATCCAAATATTTAAACTTTAATTTTAAGCACATGGGATCTTTGAGAAGTtgatcctctagcacaa

**1.3 pAX01 plasmid backbone **
用引物模拟扩增，质粒骨架

image.png

命名为：1.3 pAX01 plasmid backbone
这个质粒非常值得研究，载体上含有lacA基因的5’端和3‘端，所以在两者之间的部分（插入元件），通过双交换重组后，可以整合到染色体上的lacA位点。

1.4重构质粒
三个片段模拟克隆，构建新的质粒

image.png

命名为：1.4 pYBGB

image.png image.png

随后，作者将这个载体导入到WB800菌中，产生了外源表达BgaB的菌。

1.5 消除抗生素抗性
用引物模拟扩增，并不能匹配，序列有问题！
仍旧是将融合的PCR片段与热敏感型质粒pUS20融合，直接导入到菌中
The fragment was transformed to B. subtilis WBEmBgaB with the temperature- sensitive plasmid pUS20 by nature co-transformation. The temperature-sensitive plasmid pUS20 was subsequently cured by overnight growth without selection, generating the marker-free strain WBBgaB.
好奇，作者2017年已经建立了负筛选的pheS系统，为啥这里选择此方法？

2.1 启动子替换
启动子P43，文中引物比对不上，但是从其他文献中找到了P43序列出处
the P43 promoter from B. subtilis 168 (GenBank accession number K02174.1)
文献：Development of an Efficient Genome Editing Tool in Bacillus licheniformis Using CRISPR-Cas9 Nickase
P43(No-RBS)-F-BamHI CGGGATCCTGTAGGTGGTATGTTTTCGCTTGA
P43(No-RBS)-R (yvmC) GCTCTAAAACGTGTTTGCTCTCCATTGTAAAATGGTACCGCTATCACTTTATATT

AGCTTCGTGCATGCAGGCCGGGGCATATGGGAAACAGCGCGGACGCAGCGGAATTTCCAATTTCATGCCGCAGCCGCCTGCGCTGTTCTCATTTGCGGCTTCCTTGTAGAGCTCAGCATTATTGAGTGGATGATTATATTCCTTTTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTAAATACAGCCATTGAACATACGGTTGATTTAATAACTGACAAACATCACCCTCTTGCTAAAGCGGCCAAGGACGCTGCCGCCGGGGCTGTTTGCGTTTTTGCCGTGATTTCGTGTATCATTGGTTTACTTATTTTTTTGCCAAAGCTGTAATGGCTGAAAATTCTTACATTTATTTTACATTTTTAGAAATGGGCGTGAAAAAAAGCGCGCGATTATGTAAAATATAAAGTGATAGCGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAACAGACAAGAATTAATAACAGAAGCTT

2.2 PxylA
质粒pAX01中也有PxylA 启动子，但是与本文描述不一致。

image.png

从基因组中模拟扩增P13+P14（1400bp）， inducible PxylA promoter

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题外话：
作者学位论文还对PxylA木糖诱导启动子进行优化。
１. PxylA整合载体构建
pPXYB

2. PxylA核心区域突变
   主要是-35区域和-10区域引入突变
   3.阻遏蛋白启动子替换
   本土的启动子替换为grac启动子
   引入spc抗性

2.3 PsrfA
从基因组中模拟扩增

>PsrfA
AAGACGCTCTTCGCAAGGGTGTCTTTTTTTGCCTTTTTTTCGGTTTTTGCGCGGTACACATAGTCATGTAAAGATTGTAAATTGCATTCAGCAATAAAAAAAGATTGAACGCAGCAGTTTGGTTTAAAAATTTTTATTTTTCTGTAAATAATGTTTAGTGGAAATGATTGCGGCATCCCGCAAAAAATATTGCTGTAAATAAACTGGAATCTTTCGGCATCCCGCATGAAACTTTTCACCCATTTTTCGGTGATAAAAACATTTTTTTCATTTAAACTGAACGGTAGAAAGATAAAAAATATTGAAAACAATGAATAAATAGCCAAAATTGGTTTCTTATTAGGGTGGGGTCTTGCGGTCTTTATCCGCTTATGTTAAACGCCGCAATGCTGACTGACGGCAGCCTGCTTTAATAGCGGCCATCTGTTTTTTGATTGGAAGCACTGCTTTTTAAGTGTAGTACTTTGGGCTATTTCGGCTGTTAGTTCATAAGAATTAAAAGCTGATATGGATAAGAAAGAGAAAATGCGTTGCACATGTTCACTGCTTATAAAGATTAGGGGAGGTATGACAATATG

image.png

引物扩增strain WBBgaB待替换启动子的左端同源臂、右端同源臂，然后与启动子进行融合，直接导入到菌株中。方法如上所述。
Three fused fragments with promoter-driven bgaB expression cassettes were separately transformed to B. subtilis WB800 by nature co-transformation described
above.

根据实验结果:
The mutant promoter NBP3510 showed superior activity to all of the other promoters and the BgaB expression was twofold higher than that of the P3510 (Fig. 3b, c and
Additional file 1: Figures S5, S6) and enhanced by 26-fold compared with that of the WT promoter.
作者最后突变优化后的PxylA启动子序列为：

Optimized promoter
ttgtgctagaggatcaACTTCTCAAAGATCCCATttaaaaattttttttaaaaaaaTATttgacaTTTTTAAATAAAGCGTTtataatATATGTAGAAACAACAAAGGGGGAGATTTGTTTGACAAAGGTAGAACGTatgaatgtgttatcctcaatttg