收细胞:
细胞铺皿,,然后收蛋白
先把培养基液吸走
Pbs洗培养皿。 1*pbs
细胞刮。
用枪冲,然后吸到小瓶里
离心。(离心机要提前开) 液体一样多。配平。
3000转,5min (裂解细胞成碎片) 看细胞的状态,太快容易碎
把水抽出来(细针管)
(最近用放-20度,以后用放-80)
收蛋白
加80ul裂解液(990ulRIPA+10ulPMSF分装)(是细胞量的5~6倍),吹悬,冰上裂解30min
超声破碎仪:破碎细胞。 先用水洗一下头,再用纸擦一下,每个ep管里的细胞破碎2次,一直在冰上 20min
离心,把蛋白离心出来:12000转,20min
取上清,放入新ep管(部分pr定量,部分继续下面步骤)
加5*loading buffer:是提取的蛋白样量的1/4。
煮样:100°,5min,用板子压着ep管(-20保存)
上样前再煮2min
提的是细胞总蛋白,用特异性抗体识别抗原
western 设置的3组对照:正常癌细胞,空转组,敲低组
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