刘小泽写于18.12.17
组学分析离不开比对环节，可能流程已经会了，但这不是根本。我们需要再深入学习一下关于短序列比对的一些知识，这样以后再分析的时候，就更能明白我们自己在做些什么
短序列是什么？
一代测序一般都测的比较长（1000bp左右）并且准确率很高，能到99.9%，但最大的缺点就是：这么好的技术却不能大批量应用，只能一条一条测，耗时耗钱。从2005年左右，二代测序的短读长、高通量开始迅速发展，产生的reads和一代有着显著的不同：序列长度明显降下来了（50-300bp），一次测序产量明显上去了（一次上亿条reads）。这里不讨论测序仪怎么做到的输出短序列，只需要知道二代测序带给我们的结果一是短，二是多就行了。
有了输出的短序列，然后呢？
它们的用处一般有两个：一个是比对到参考基因组（也就是重测序 re-sequencing流程），另一个就是相互比对进行叠加（也就是组装的过程，reads=》contig=》scaffold等）。这些工作都是靠比对工具完成的，我们称之为：“short read aligners” OR "short read mappers"
比对工具怎么完成的？
首先，让我们感谢那些短序列比对工具（以下简称“工具”）的作者，生信界有了他们才有了不同组合的流程，才推动了不同的组学研究。他们设计的一个好的工具可以在1秒内比对超过一万条序列到人类基因组的30亿bp碱基上
比对一般需要寻找exact matches、missing locations 以及partial and alternative matches/overlaps ，但是这几个任务每个软件都有自己的擅长与不足。另外，根据数据类型（domain-specific）表现也不同
当然，工具也有自己的劣势，大部分的工具只能根据阈值去寻找和目标区域相似的比对结果，高相似性优先，因此有部分会因阈值设定被抛弃；当序列过长或过短时，就会受到限制，例如研究small RNA这种低于30nt的序列，可选的比对工具就是少之又少，因为对比对算法的精确度要求更高
alignment vs mapping
说起比对，我们一般都会想起来这两个词，但是严格来说，它们还是有区别的：mapping强调的是不要求比对的准确度，能有比对就可以，是region层面上的，它的目的就是看看基因组上有没有一块区域可以安放这条序列；而alignment强调精确比对，是碱基层面上的
李恒关于这二者做过自己的解释：
Mapping
- A mapping is a region where a read sequence is placed.
- A mapping is regarded to be correct if it overlaps the true region.
Alignment
- An alignment is the detailed placement of each base in a read.
- An alignment is regarded to be correct if each base is placed correctly.
例如：如果研究SNPs和基因组内变异，应该就是用alignment的工具；如果研究RNA-seq就是用mapping的工具，因为RNA-seq一般我们就想知道这个序列从哪里来的就好了，没必要知道比对上多少
这么多工具，如何选择？
其实工具很多，能被大众接受的很少，因此软件开发之路十分艰难，其实大部分的开发者并没有得到关注。
这里用的最多的当属bwa和bowtie2 ，选择的话一般就是根据喜好和信仰充值了。我们知道bwa是曾经的博德研究所的李恒开发的，国人的肯定要支持；另外华大也开发了一个novoalign 喜欢BGI的也可以关注。但是不管怎样，一个比对项目，可以多用几种工具分析分析，增加自己结果的可信度
另外，在选择工具的时候，我们要根据自己的实际需求，自己做一个心理暗示(mental checklist)：
- 比对算法：
global, local or semi-local - 工具遇到INDEL怎么处理？
- 工具可以跨大片段区域比对吗？
- 工具可以进行根据阈值过滤吗？阈值设置？
- 工具可以找到嵌合体比对吗？
选择一个最常用的bwa研究下
bwa的背景
bwa是Burrows-Wheelers Aligner的缩写，应该是目前使用最为广泛的，后期会搭配同作者的samtools使用
当时李恒在发表这个bwa算法的时候，那时已经好多人在用了，还被拒稿，为此他写过一封信：
生信有一个特点，就是：更新速度快，可能有的软件还不知道名字就已经被淘汰了。身处前端的bwa也是不断的更替版本，之前的算法是 bwa aln，现在是bwa mem【这里的mem指的是Maximally Exact Matches】。因此如果采用不同的算法，虽然都是bwa，但结果还是有差别。这就是有时让人纠结的地方，因为不清楚作者软件的版本更替，于是，最好的办法就是用熟练github，自己去找（当然，我也在努力的道路上）
bwa准备工作
一般来讲，使用bwa比对之前需要根据参考基因组构建索引index ，目的就是快速搜索基因组。一般参考基因组放一个目录，然后构建的index放另一个目录，随时取用。
bwa小练习
将埃博拉病毒测序的reads比对到它的参考基因组上（命名为1976.fa）
先构建索引
mkdir -p ~/tmp/bwa_test/ref
# 下载基因组(19Kb)[安装entrez-direct]
conda install -c bioconda entrez-direct
efetch -db=nuccore -format=fasta -id=AF086833 > ~/tmp/bwa_test/ref/1976.fa
# 构建索引
ref=~/tmp/bwa_test/ref/1976.fa
bwa index $ref
# ls ~/tmp/bwa_test/ref
然后下载测试数据
mkdir -p ~/tmp/bwa_test/raw && cd ~/tmp/bwa_test/raw
# 获取全部的埃博拉病毒项目的测序数据
esearch -db sra -query PRJNA257197 | efetch -format runinfo > runinfo.csv
# 挑选SRR1972739下载
cat runinfo.csv| grep SRR1972739 | cut -d "," -f 10 | xargs -n1 wget {}
# 解压成fq文件 [为了测试，选取前1万条reads]
fastq-dump -X10000 --split-files SRR1972739
比对
比对默认得到sam格式（Sequence Alignment Map），其中包括了所有的比对信息，之后再也不用看fastq了
mkdir -p ~/tmp/bwa_test/align && cd ~/tmp/bwa_test/align
r1=~/tmp/bwa_test/raw/SRR1972739_1.fastq
r2=~/tmp/bwa_test/raw/SRR1972739_2.fastq
ref=~/tmp/bwa_test/ref/1976.fa
baw mem $ref $r1 $r2 > bwa.sam
至于Bowtie2，也有自己的用法，不过是将索引换成了
bowtie2-build，
然后比对的时候bowtie2 -x $ref -1 $r1 -2 $r2 > bowtie.sam运行结束后，会给个报告
软件的比较？
如果只考虑时间的话，bwa要快一些，当然这也是有原因的：bowtie2产生的结果中包含有更多的信息，例如，同时看下它们的tag部分：
cat bwa.sam | cut -f 12-20 | head
cat bowtie.sam | cut -f 12-20 | head
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