今天这个小笔记主要是给自己兵荒马乱的一天做一个小总结。
举🌰：
我们需要在质粒上连一个序列，比如EGFP吧，那么我们应该怎么着手设计呢？
Part1 ：选择内切酶的时候，需要注意以下几点：
第一，首选双酶切系统，那么这样的话可以尽量的避免载体自连的情况。
第二，在选了双酶切的基础上，为了避免“同尾”的情况出现（也就是即使是采取了双酶切，但是酶切后导致了同样的粘性末端，大家可以看一下同尾酶表
）
第三，在选择酶的时候，一定要考虑一下buffer能不能兼容，如果这两个酶切的酶是同一个buffer（如cutsamrt）就最好了，可以一起酶切。如果buffer不一样的话，需要考虑一下兼容性。
Part2: 那接下来看一下如何加酶切序列
我选定的时EGFP序列，首先我来看一下这个序列的基本信息：
pegfp 质粒含有EGFP序列
我们需要把这一段序列pcr下来，那么点开sequence，可以看到如下，选取大概20-30bp左右的序列（有合适的退火温度和合适的GC含量就可以）
EGFP起始位置
EGFP终止位置
Part3: 如何加上酶切序列？保护碱基是什么呢？
因为我的目的质粒上选的是KpnI XhoI这两个酶切位点，查了一下这两个酶的NEB的buffer 是一样的。那么好，我们来查一下这两个酶的酶切碱基。内切酶的保护碱基表
Q：为什么需要保护碱基？
A：内切酶会占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA并发挥切割DNA作用是有很大影响。
我们根据上表选择一个合适的序列，当然是选择酶切效率高一些的序列：
酶切表，后面两列是2小时和20小时的酶切效率
KpnI 保护碱基
Part4: 找到了保护序列，还有目的序列的CDS，然后呢？
引物的设计原则：
1：上游引物：5‘-保护碱基+酶切位点+Kozak（可以提高转录效率，可选择加不加）+ATG起始的目的基因序列-3‘
2：下游引物： 5‘-保护碱基+酶切位点+终止密码子+目的基因序列-3’
那么根据我的内切酶加上内切酶的序列，可以得到的引物是：
F/R引物
REF：
1： 酶切位点，保护碱基，kozak序列，这些引物设计要素你掌握了么- 知乎
2：https://wenku.baidu.com/view/0fb0ca1cb7360b4c2e3f644d.html?re=view
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